Генетични рекомбинации: трансдукция, трансформация, конюгация, транспозиция. Концепцията за генното инженерство. Характеристики на конструиране на генетични карти в прокариоти Характеристики на бактериална рекомбинация трансформация трансдукция и конюгация
Комбинативни промени.
Появяват се в резултат на трансформация и конюгация. Трансформацията е процес на преместване на сайт генетичен материалДНК, съдържаща една двойка нуклеотиди от донорната клетка до рецепторната клетка.
Има 5 етапа в процеса на трансформация:
1) Адсорбция на трансформираща ДНК върху повърхността на микробна клетка;
2) Проникване на ДНК в реципиентната клетка;
3) Сдвояване на въведената ДНК с хромозомните структури на клетката;
4) Включване на ДНК участък от донорната клетка в хромозомните структури на реципиентната клетка;
5) Допълнителни промени в нуклеотида по време на последващи деления. Оптималната температура на трансформация е 29-32ͦС.
Трансдукцията е промяна, при която генетичният материал на донорна клетка се прехвърля в реципиентна клетка от трансдуциращ (умерен) фаг, т.е. фаг, който не причинява неговото унищожаване.
Има три вида трансдукция:
1) Общо (неспецифично), прехвърлянето на различни или няколко характеристики може да се случи едновременно.
2) Специфични, характеризиращи се с предаване само на определена черта.
3) Абортивен, участък от ДНК от донорна клетка, прехвърлен от фаг към реципиентна клетка, не е включен в нейния геном.
Конюгацията е форма на полов процес, при който мъжките и женските микробни клетки се свързват и между тях се обменят ядрени вещества.
В този случай генетичният материал на донорната клетка преминава в реципиентната клетка. След рекомбинация и клетъчно делене се образуват форми с характеристиките на конюгиращи клетки.
Така и трите форми на комбинирана променливост (трансформация, трансдукция, конюгация) са различни по форма, но еднакви по същество. По време на трансформацията, част от ДНК на донорната клетка навлиза в реципиентната клетка; по време на трансдукцията тази роля се играе от фага, а по време на конюгацията, трансферът генетична информацияосъществява се през цитоплазмен мост (пили).
рикетсия
Грам-отрицателни микроби. Форма: къси пръчици или коки. Рикетсиите имат клетъчна стена, която е подобна на клетъчната стена на грам-отрицателните бактерии.
Те се класифицират като истински бактерии. Прокариоти.
Нитрификация.
Продуктите от разпадането на протеините и разграждането на уреята - амоняк и амониеви соли - могат директно да се абсорбират от растенията, но обикновено се превръщат в нитратни соли на азотна киселина.
В първата фаза на нитрификация амонякът се окислява до азотна киселина по схемата
DG = -662kJ/mol.
Процесът на нитрификация протича на няколко етапа, като се образуват редица междинни продукти: хидроксиламин, нитроксид и др.
Във втората фаза азотната киселина се окислява до азотна киселина:
DG= -201kJ/mol.
Първата и втората фаза на единичния процес на нитрификация се причиняват от различни патогени. С.Н. Виноградски ги комбинира в три рода:
1) Nitrosomonas. Те са пръчковидни, грам-отрицателни, подвижни, снабдени с един флагел и не образуват спори. Те са широко разпространени в почвата и се различават една от друга по форма и размер.
2) Нитрозоцистис. Способен да образува зооглея (кокови форми на микроби около капсулата)
3) Нитрозоспира. Делят се на два вида. И двата вида бактерии имат правилна спираловидна форма. Заедно със спирално усукани нишки, къси пръчици и коки се срещат в старите култури.
Наскоро бяха идентифицирани още два рода микроби, които причиняват първата фаза на нитрификация.
Нитрифициращите бактерии имат отрицателно отношение към органичните вещества. В разтворите се наблюдава силна чувствителност на нитрифициращите микроби към органични вещества; Това не се наблюдава в почвата, т.к Никога не съдържа водоразтворими вещества в значителни количества.
Процесите на окисляване на амоняка се влияят не само от микробите, но и от техните ензими. С изключение органична материяНитрификацията се влияе от концентрацията на амоняк. Ефектът му върху културата се проявява рязко в течни среди. В почвата амонякът е в адсорбирано състояние и не може да има инхибиторен ефект. Следователно Nitrobacter незабавно окислява азотната киселина в азотна киселина.
Наличието на кислород има положителен ефект върху процеса на нитрификация. В култивираните почви процесът на нитрификация протича по-интензивно.
Тема: Генетика на микроорганизмите 1. Конюгация, трансдукция, трансформация. 2. Изменчивост на микроорганизмите. 3. Използване на постиженията на бактериалната генетика.
Наследственият апарат на бактериите има редица характеристики: бактериите са хаплоидни организми, т.е. имат 1 хромозома. В тази връзка, когато се наследяват черти, няма феномен на доминиране; Бактериите имат висока скорост на възпроизвеждане и поради това няколко десетки поколения бактерии се сменят за кратък период от време (дни). Това дава възможност да се изследват огромни популации и доста лесно да се идентифицират дори мутации, които са редки по честота. Наследственият апарат на бактериите е представен от хромозома. Бактериите имат само един. Бактериалната хромозома е ДНК молекула. Дължината на тази молекула достига 1,0 mm и за да се "побере" в бактериална клетка, тя не е линейна, както при еукариотите, а е супернавита в бримки и сгъната в пръстен. Този пръстен е прикрепен към цитоплазмената мембрана в една точка. Индивидуалните гени са разположени на бактериалната хромозома. U коли, например, има повече от 2 хиляди от тях.
2. Функционалните единици на бактериалния геном, в допълнение към хромозомните гени, са: IS последователности; транспозони; плазмиди. IS последователностите (английски insertion - вмъкване, sequence - последователност) са къси ДНК фрагменти. Те не носят структурни гени (кодиращи конкретен протеин), а съдържат само гени, отговорни за транспонирането (способността на IS последователностите да се движат по хромозомата и да се интегрират в различните й участъци). IS последователностите са еднакви различни видовебактерии. Транспозоните са ДНК молекули, по-големи от IS последователностите. В допълнение към гените, отговорни за транспонирането, те съдържат и структурен ген, кодиращ определена черта. Транспозоните (Tn елементи) се състоят от 2000-25 000 нуклеотидни двойки, съдържат ДНК фрагмент, носещ специфични гени, и два крайни IS елемента. Всеки транспозон обикновено съдържа гени, които въвеждат важни характеристики за бактерията, като множествена резистентност към антибактериални средства. Като цяло транспозоните се характеризират със същите гени като плазмидите (гени за антибиотична резистентност, образуване на токсини, допълнителни метаболитни ензими). Транспозоните се движат лесно по хромозомата. Тяхната позиция влияе върху експресията както на собствените им структурни гени, така и на съседните хромозомни. Транспозоните могат да съществуват и извън хромозомата,
Плазмидите са кръгли суперспирални ДНК молекули. Тяхното молекулно тегло варира в широки граници и може да бъде стотици пъти по-голямо от това на транспозоните. Плазмидите съдържат структурни гени, които придават на бактериалната клетка различни свойства, които са много важни за нея: R-плазмиди - лекарствена резистентност; Col-плазмиди - способността да синтезират колицини; F-плазмиди - предават генетична информация; Токс плазмиди - синтезират токсин; Плазмиди за биоразграждане - разрушават един или друг субстрат и т.н. Плазмидите могат да бъдат интегрирани в хромозомата (за разлика от последователностите на IS и транспозоните, те са вградени в строго определени области), или могат да съществуват автономно. В този случай те имат способността да се репликират автономно и затова в една клетка може да има 2, 4, 8 копия на такъв плазмид. Много плазмиди съдържат гени за предаване и могат да се прехвърлят от една клетка в друга чрез конюгация (обмен на генетична информация). Такива плазмиди се наричат трансмисивни.
При бактериите има 2 вида изменчивост - фенотипна и генотипна. Фенотипната изменчивост - модификация - не засяга генотипа, но засяга по-голямата част от индивидите в популацията. Модификациите не се наследяват и избледняват с времето, т.е. те се връщат към оригиналния фенотип чрез по-голям (дългосрочни модификации) или по-малък (краткосрочни модификации) брой поколения. h Генотипната вариация засяга генотипа. Основава се на мутации и рекомбинации. Мутациите в бактериите не се различават фундаментално от мутациите в еукариотните клетки. Характеристика на мутациите в бактериите е относителната лекота на тяхното идентифициране, тъй като е възможно да се работи с големи популации от бактерии. По произход мутациите могат да бъдат: спонтанни; индуциран. По дължина: точково; генетични; хромозомна. Насоченост: права; - обратен.
Рекомбинацията (обмяна на генетичен материал) при бактериите се различава от рекомбинацията при еукариотите: бактериите имат няколко механизма на рекомбинация; по време на рекомбинация в бактериите не се образува зигота, както при еукариотите, а мерозигота (носи цялата генетична информация на реципиента и част от генетичната информация на донора под формата на добавка); В рекомбинантната бактериална клетка се променя не само качеството, но и количеството на генетичната информация.
Конюгация При бактериите, метод за прехвърляне на генетичен материал от една бактериална клетка в друга. В този случай две бактерии са свързани с тънък мост, през който парче дезоксирибо нишка преминава от една клетка (донор) към друга (реципиент). нуклеинова киселина(ДНК). Наследствените свойства на реципиента се променят в съответствие с количеството генетична информация, съдържаща се в прехвърлената част от ДНК.
Конюгация Конюгация (от латински conjugatio - връзка), парасексуален процес - еднопосочен трансфер на част от генетичния материал (плазмиди, бактериална хромозома) с директен контакт на две бактериални клетки. Открит през 1946 г. от J. Lederberg и E. Taitem. То има голямо значениев природата, защото насърчава обмена полезни знаципри липса на истински полов акт. От всички процеси на хоризонтален трансфер на гени, конюгацията позволява трансфера най-голямото числогенетична информация.
Конюгацията е обменът на генетична информация в бактериите чрез прехвърлянето й от донор на реципиент чрез директен контакт. След образуването на конюгационен мост между донора и реципиента, през него една верига от донорна ДНК навлиза в реципиентната клетка. Колкото по-дълъг е контактът, толкова повече от донорната ДНК може да бъде прехвърлена на реципиента. Въз основа на прекъсването на конюгацията на определени интервали е възможно да се определи редът на гените в бактериалната хромозома - да се конструират хромозомни карти на бактерии (карта на бактерии). F+ клетките имат донорна функция.
Трансдукция Естер Ледерберг успя да изолира бактериофаг ламбда, ДНК вирус, от Ешерихия колиК 12 през 1950 г. Действителното откритие на трансдукцията се свързва с името на Джошуа Ледерберг. През 1952 г. те, заедно с Нортън Зиндър, откриват общата трансдукция. През 1953 г. Lederberg и съавтори демонстрират съществуването на абортивна трансдукция, а през 1956 г. - специфична трансдукция.
Трансдукцията е обменът на генетична информация в бактериите чрез прехвърлянето й от донор към реципиент с помощта на умерени (трансдуциращи) бактериофаги. Трансдуциращите фаги могат да прехвърлят 1 или повече гени (белези). Трансдукцията може да бъде: специфична – винаги се пренася един и същ ген; неспецифични – предават се различни гени. Това се дължи на локализацията на трансдуциращите фаги в донорния геном: в случай на специфична трансдукция, те винаги се намират на едно и също място в хромозомата; когато са неспецифични, тяхната локализация е непостоянна.
Ориз. 2. Трансдукция 1 - бактерия - донор (В+), 2 - фаг, 3 - репродукция, 4 - адсорбция, 5 - бактерия - реципиент (В-), 6 - бактерия - реципиент с ново свойство.
Трансформацията е обмен на генетична информация в бактериите чрез въвеждане на готов ДНК препарат (специално приготвен или директно изолиран от донорната клетка) в реципиентната бактериална клетка. Най-често предаването на генетична информация се случва, когато реципиентът се култивира върху хранителна среда, съдържаща донорна ДНК. За да възприеме донорната ДНК по време на трансформацията, реципиентната клетка трябва да бъде в определено физиологично състояние (компетентност), което се постига чрез специални методи за обработка на бактериалната популация или възниква спонтанно. По време на трансформацията се предават единични (обикновено 1) характеристики. Трансформацията е най-обективното доказателство за връзката на ДНК или нейните фрагменти с определен фенотипен признак, тъй като в клетката реципиент се въвежда чист ДНК препарат.
Ориз. 3. Трансформация на капсулния щам на бактерии (1), когато се инокулира, дава растеж (6). Няма растеж след варене на тази култура (7). Резултатът от такъв експеримент с некапсулиран щам (4 - растеж +, 8 - растеж -) е подобен. Комбинирането на екстракта от капсулния (1) и жива култура от капсулния (3) щам в един контейнер, последвано от засяване, дава растеж на капсулния щам (5).
Свойства на клетките на колониите S - и R-форми S-форма R-форма Колониите са грапави, непрозрачни с неравни ръбове, често набръчкани Камшичетата често липсват Капсули или лигавичен слой липсват Биохимично по-малко активни Леко вирулентни или авирулентни Антигенно дефицитни Слабо чувствителни към фаги Суспензия бързо се утаява, ронлива утайка, полиморфни клетки Колониите са прозрачни, с гладка лъскава повърхност, кръгли, с гладки ръбове, изпъкнали Подвижните видове имат флагели При капсулните видове капсулата или лигавичният слой е ясно видим Биохимично по-активен При патогенните видове се изразяват вирулентни свойства Антигенно завършени Чувствителни към фаги Суспензия клетки в физиологичен разтворхомогенни, стабилни, клетки с нормален размер
Генетичната рекомбинация при еукариотите е образуването на индивиди с нова комбинация от характеристики в резултат на половия процес. Новият индивид получава няколко гена от един родител и няколко от друг, генетично различен родител. Поради процеса на рекомбинация, броят на наследствени променикоито могат да бъдат повлияни от селекция.
При прокариотите генетичната рекомбинация е така нареченият парасексуален процес. При тези организми са известни три процеса, чрез които генетичният материал от двама различни родители може да се рекомбинира. Това са трансформация, конюгация и трансдукция. Въпреки това, при нито един от тези процеси не се случва истинско клетъчно сливане или пълно сливане на нуклеоиди. Само част от генетичния материал на клетката донор се прехвърля в клетката реципиент. Така реципиентът става диплоиден, защото част от неговия генетичен материал се допълва от генетичния материал на донора.
В такава непълна зигота, наречена мерозигота, образувана в резултат на трансфер на ген, генетичният материал на реципиентната клетка се нарича ендогенен, а генетичният фрагмент, прехвърлен от донора, се нарича екзогенен. Обикновено екзогенните и ендогенните части са свързани и обменят сегменти веднага след трансфера.
Трансформацияе процес на генен трансфер, при който част от ДНК на донорна клетка, получена или чрез екстракция, или чрез естествен клетъчен лизис, може да проникне в сродна (от същия вид или близък вид) реципиентна бактериална клетка. В резултат на това фрагменти от ДНК хромозомата на донора се включват в ДНК на реципиента, което води до промяна в характеристиките на реципиентната бактерия.
Процесът на трансформация може да бъде разделен на няколко етапа: 1 - контакт на ДНК с клетъчната повърхност; 2 - проникване на ДНК в клетката; 3 - свързване на трансформираща ДНК със съответния фрагмент на реципиентната хромозома. По-нататъшният процес е свързан с рекомбинацията на част от екзогенната трансформираща ДНК молекула с реципиентната ендогенна хромозомна ДНК. Последен етап- репликация на нова информация, включена в хромозомата.
В лабораторни условия трансформацията се извършва по следния начин. ДНК на определен щам бактерии се извлича, пречиства и смесва с клетки от бактерии от друг щам, който се различава от първия по едно или повече наследствени свойства. Културата на експерименталния микроорганизъм се оставя да расте. Сред потомството могат да бъдат намерени малък брой клетки с някои свойства на щама, от който е извлечена ДНК.
Много рядко се случва една бактериална клетка да придобие повече от едно ново свойство в резултат на трансформация. Предаването на по-голям брой признаци чрез ДНК се наблюдава само ако културата на донорния микроб е генетично близка до клетките на реципиентния микроб.
С помощта на трансформиращата се ДНК могат да се предават характеристики като образуване на капсула, синтез на вещества, необходими за клетката, ензимна активност, устойчивост на отрови, антибиотици и други. лекарствени вещества.
Трансформация се наблюдава при много бактерии, по-специално при представители на родовете Bacillus, Rhizobium, Streptococcus и др.
Конюгация- процес, при който близки родителски клетки се свързват, обикновено с помощта на конюгационни мостове, чрез които се обменят генетични материали. Конюгацията е изследвана в различни бактерии(Escherichia, Shigella, Salmonella, Pseudomonas), по-специално е добре проучен в Escherichia coli.
Способността на клетката да стане донор се определя от специфичния полов фактор F (от английския fertility - плодовитост), който по време на конюгацията се прехвърля от една бактериална клетка в друга. Тези клетки бяха наречени F+ клетки. Бактериалните клетки, които нямат F фактор, са реципиенти на генетичен материал и се обозначават с F. Половият фактор F е един от конюгативните плазмиди и е кръгово затворена ДНК молекула с молекулно тегло 64x106 a. Яжте. F-плазмидът причинява образуването върху клетъчната повърхност на една или две така наречени полови фимбрии или F-пили, които улесняват свързването на донорните клетки с реципиентните клетки, както и хромозомно-независимата репликация на собствената ДНК и образуване на продукти, които осигуряват трансфера на генетичен материал като F-плазмиди и клетъчни хромозоми. F-плазмидът се намира в цитоплазмата автономно, извън бактериалната хромозома. Той обаче има способността да бъде включен (интегриран) в определени местабактериална хромозома и да стане част от нея.
В резултат на интегрирането на F-плазмида в бактериалната хромозома се образува така нареченият Hfr-щам (Висока честота на рекомбинация). Когато Hfr щам се кръстоса с F - бактерии, тогава, като правило, F факторът не е такъв
Предава се и гените на бактериалната хромозома се предават сравнително висока честота. В началото на процеса на конюгация F+ или Hfr донорните клетки са свързани с реципиентните клетки (поради наличието на F-пили в донорите). Впоследствие между клетките се образува конюгационен мост и чрез него от клетката донор към клетката реципиент се прехвърля генетичният материал, F-плазмиди или хромозоми. Обикновено по време на конюгацията се прехвърля само една верига от донорна ДНК, а втората верига (комплементарна) се завършва в реципиентната клетка. Трансферът, като правило, започва от единия край на хромозомата и продължава с последващо прехвърляне на други участъци от нея (фиг. 21).
Прехвърлянето на генетичен материал може да бъде предотвратено по всяко време чрез разделяне на конюгиращи двойки чрез енергично разклащане на суспензия от микроорганизми в течна среда. В този случай само някои свойства мъжки клеткисе прехвърлят в женската клетка и могат да се проявят в потомството. Рано или късно прехвърлянето спира в повечето конюгиращи двойки, дори когато те не са изкуствено разделени. Това се случва, защото конюгационният мост е крехък и лесно се разрушава, без да се засяга жизнеспособността на клетката.
По този начин, в резултат на конюгиране, реципиентната клетка F - се превръща в мерозигота, съдържаща, поради спонтанно прекъсване на трансфера на генетичен материал, само част от донорната хромозома F + в допълнение към собствената си хромозома. В резултат на процеса на кросинговър (кръстосването на хромозоми, при който гените сменят местата си), който се наблюдава и при други организми, се образува нова комбинация от генетичен материал. В зависимост от местоположението на генетичния материал, който се обменя, различни видове рекомбинанти могат да възникнат в потомството.
Трансдукция- процес на прехвърляне на генетичен материал от една бактериална клетка в друга чрез бактериофаг. С други думи, фагът играе ролята на гамета, пренасяйки фрагмент от ДНК от клетката донор в клетката реципиент. Трансдукцията се извършва с участието на умерени фаги.
Известни са три основни вида трансдукция: обща (неспецифична), локализирана (специфична) и абортивна. При неспецифична трансдукция различни ДНК фрагменти се прехвърлят от донорни бактерии към реципиентни бактерии с помощта на умерено трансдуциращи фаги. В този случай донорният ДНК фрагмент, донесен от фага, може да бъде включен в хомоложната област на ДНК на реципиентната клетка чрез рекомбинация.
Специфичната трансдукция се характеризира със способността на фага да прехвърля само определени гени от донорни бактерии към реципиентни бактерии. Това се дължи на факта, че образуването на трансдуциращ фаг възниква в резултат на свързването на неговата ДНК със строго определени бактериални гени, разположени върху хромозомата на донорната клетка. Смята се, че всяка фагова частица носи или само един бактериален ген, или няколко близки гена.
При Абортивна трансдукцияФрагментът от хромозомата на донорната клетка, донесен от фага, не е включен в хромозомата на реципиентната клетка, но се намира в нейната цитоплазма автономно и в тази форма може да функционира. По време на деленето на реципиентната клетка трансдуцираният ДНК фрагмент на донора може да бъде предаден само на една от двете дъщерни клетки, тоест той се унаследява еднолинейно и следователно се губи в потомството.
По време на трансдукцията е възможно да се прехвърлят гени, които контролират хранителните характеристики на бактериите, тяхната устойчивост към лекарства, ензимна активност, опорно-двигателен апарат(камшичета) и други свойства.
Трансферът на белези чрез процеса на трансдукция е установен при представители на родовете Bacillus, Pseudomonas, Salmonella, Escherichia и др.
Трансформация - промяна в наследствените свойства на клетката в резултат на проникване или изкуствено въвеждане на чужда ДНК в нея. Естеството на трансформиращия фактор е установено от Ейвъри и Маклауд през 1944 г. Само тези бактерии могат да бъдат трансформирани в клетки, в които двойно-верижната (интактна) ДНК с високо молекулно тегло може да проникне. Способността за усвояване на ДНК е компетентност и зависи от физиологично състояниеклетки. ДНК може да се абсорбира по време на специфична кратка фаза на промяна на клетъчната повърхност. С помощта на ДНК могат да се предават такива характеристики като образуване на капсули, синтез на вещества, ензимна активност, резистентност към отрови, антибиотици.Всяка ДНК може да проникне в компетентна клетка, но рекомбинацията се случва само с ДНК на сроден вид. Конюгация - трансфер на генетичен материал чрез директен контакт между 2 клетки. Изследван от Lederberg и Tatum през 1946 г. върху мутанти на Escherichia coli. Един мутант беше открит в аминокиселини A и B, но успя да синтезира C&D, вторият беше компетентен за това (A-B-C+D+). Тези мутанти не растат и не образуват колонии върху минимална хранителна среда, но ако към нея се добави суспензия от двата мутанта, се появяват колонии. Клетките на тези колонии имат наследствена способност да синтезират всички аминокиселини (A+B+C+D+).Тук конюгацията служи като предпоставка за рекомбинация. При изследване на бактерии беше установено, че способността на клетката да бъде донор е свързана с наличието на фактор F (F + клетки, които не съдържат фактор - F- и могат да функционират като реципиент) - плазмид, кръгов , двойноверижна ДНК молекула. Че. Реципиентните клетки стават донори в резултат на конюгация, но хромозомните характеристики не се прехвърлят. F-плазмидът предизвиква образуването на полови фимбрии/F-пили върху клетката, които служат за разпознаване при контакт между клетка донор и клетка реципиент и правят възможно образуването на мост, през който ДНК преминава в клетката. Конюгацията е често срещана при ентеробактериите и прокариотите. трансдукция - пасивен трансфер на бактериални гени от една клетка в друга от частици бактериофаг, което води до промяна в наследствените свойства на клетката. Има 2 вида трансдукция: а) Неспецифична – при която всеки фрагмент от ДНК на гостоприемника може да бъде пренесен (ДНК на клетката гостоприемник се включва във фаговата частица / към собствения й ген / вместо нея); б) Специфичен - може да се прехвърли строго определен ДНК фрагмент; някои фагови гени се заменят с гени на гостоприемника). И в двата случая фагите са дефектни, т.е. губят способността си да лизират клетките.
38. Фактори на резистентност (r-фактори). Свойства на плазмидите. Транспозони.
1. Съпротива– резистентни организми към всякакви антигени. Открити са бактерии, устойчиви на някои антибиотици. През 50-те години в Япония (причинителите на дизентерия. Има много бактериални инфекции и това може да се предаде на други бактерии. R-факторите съдържат гени, които правят клетката резистентна към определени антибиотици. Някои R-фактори предизвикват резистентност веднага към 8 антибиотика , и други R-фаги дават резистентност към тежки метали (живак, никел, кадмий) R-плазмидът носи 2 групи гени: 1) генът, отговорен за трансфера на плазмида чрез конюгация (tra гени) и те са т.н. наречени „резистентни трансферни фактори (RTF), 2) гени, които определят действителната резистентност и техния състав. Състои се само от малка част от плазмида.
RTF включва всички гени, отговорни за трансфера на фактор R от клетка в клетка, който се осъществява чрез конюгация. Тоест, фактор R, както и фактор F, е инфекциозен. Възможно е прехвърляне на R-фактора между няколко различни рода бактерии, което допринася за по-нататъшното им разпространение. Фермитативната химична модификация на антибиотиците е основната причина за резистентност към тях поради плазмидите. Например, канамицин и неомицин са фосфорелирани, а пинпицинът е инактивиран от пеницилиназа. поск. В наличност Тъй като R-фактори е възможна генетична рекомбинация, тогава може да възникне нова комбинация от гени, която ще осигури допълнителни свойства на устата. R факторите са от голямо значение за химиотерапията.
2. Бактериоцини. Много бакт.синтетични протеини, Юкотор. Убива сродни видове или щамове или инхибира растежа им. Тези протеини се наричат бактериоцини. Те са кодер. Специални плазмиди, наречени бактериоциногенни фактори. Бактериоцините са изолирани от Escherichia coli (колицини) и други бактерии. Името бактериоцини се дава от производствената форма на бактериите, например стафилококите произвеждат стафилоцини. неорганични вещества, които убиват бактериите, наречени антисептици.
3. Други разпознавания, дефинирани от плазмиди.Плазмидите могат да съдържат гени, които осигуряват редица специфични биологични свойства, които при определени условия създават селективно предимство. В плазмидите могат да бъдат намерени гени за ензими, необходими за разграждането на кампифора, салицилова киселина и други необходими субстрати. Списъкът на свойствата, наследени от плазмидите, включва: фиксиране на азот, образуване на нодули, абсорбция на захар, синтез на хидрогеназа и др. Някои от тези свойства могат да се определят от гените на бактерията. Хромозоми (обмен на гени между хромозоми и плазмиди). Плазмидите изиграха важна роля в еволюцията на прокариотите.
4. Несъвместимост.Много бактерии съдържат плазмиди с различни размери. Съвместното съществуване на различни плазмиди в една клетка показва, че такива плазмиди са съвместими един с друг. Но два свързани плазмида не могат да съществуват едновременно в една клетка; те са несъвместими. Всички плазмиди принадлежат към една и съща група несъответствия: плазмидите принадлежат към една и съща група несъответствия.
транспозони –Това са ДНК последователности, които могат да бъдат интегрирани в много части на генома и могат да бъдат „транспортирани“ от плазмид до бактериална хромозома или до друг плазмид. Транспазоните съдържат гени, които определят външни характеристики, а именно резистентност към такива антибиотици като пиникон, тетрациклин и др. Във връзка с това те са по-лесни за откриване от IS - El-ty (чужда ДНК, представителна .е вмъкване. след срещи в бактериални хромозоми и плазмиди.). От двете страни на гените на устата, които са разположени вътре в транспозона, местоположението на 2 е еднакво в последователност, която може да върви в една и съща или противоположна посока. Тези повтарящи се последователности на ДНК бази са частично идентични с IS - Els.
41. Еволюция на м/оов.
Клетките на всички живи същества, от примитивни форми до високо организирани, се състоят от едни и същи структурни елементи и използват едни и същи механизми за получаване на енергия и растеж. Това е биохимичното единство на всички живи организми. В процеса на еволюцията се е случило формирането и формирането на различни форми на живи същества. За процеса на еволюция на живота е необходимо да си представим какви условия са били на Земята, при които спонтанното зараждане на живот се е оказало възможно. В периода след образуването на Земята върху нея протичат активни биологични процеси, които променят облика й и довеждат до образуването на земната кора, хидросфера и атмосфера. Когато органичните вещества на Земята се натрупаха в големи количества => възникнаха условия, при които можеше да се осъществи преходът от химическата еволюция към появата на първите самовъзпроизвеждащи се живи същества. Характерно за жизнените клетки е, че винаги се появяват под формата на определени структури, които са пространствено изолирани от външната среда, но постоянно взаимодействат с нея според типа отворени системи. Предполага се, че следващият етап от еволюцията по пътя към появата на живота е формирането на определена структурна организация - абиогенно синтезирани органични съединения. Те имаха сферична форма, диаметър 0,5-7 микрона, наподобяваха кокоидни форми на бактерии, съдържаха протеиноиди и имаха известна стабилност. Оцветяването по Грам разкри, че микросферите, образувани от кисели протеиноиди, са gr-, а тези, образувани от основни протеиноиди, са gr+. Този етап е преходен етап от химическата към биологичната еволюция и възникващият модел може да се определи като пребиологичен естествен подбор. Впоследствие се предполага, че първите прокариоти могат да се появят в резервоари, където има много органични вещества.Има организми, които съществуват поради ферментация и имат основните функции на анаеробния метаболизъм. Ако приемем, че по това време в резервоарите е имало сулфати, тогава следващият етап от еволюцията е бил ефективният транспорт на електрони със създаването на протонен потенциал като източник на енергия за регенерация на АТФ. Освен това експериментално е доказано, че в началния етап на еволюцията прокариотите могат да се възпроизвеждат и да предават информация на потомството без участието на нуклеинови киселини. За по-нататъшното развитие на прокариотите беше необходимо да се създаде специален апарат, който да осигури точно възпроизвеждане на полипептиди. Това доведе до формирането на нов механизъм на синтез - шаблонен синтез, който се основава на използването на свойствата на полинуклеотидите. Свойството на полинуклеиновите молекули е способността да се възпроизвеждат точно, въз основа на принципа на структурната комплементарност.
Основното събитие в еволюцията: преходът от първичната редуцираща атмосфера към атмосфера, съдържаща кислород. Бактериите са разработили нов тип метаболизъм - аеробно дишане, което стана възможно в резултат на трансформацията на цитохромите в крайни оксидази, използвайки O 2 молекули като акцептор на електрони. Предполага се, че преди 2 милиарда години всички фототрофни прокариоти вече са съществували и съществуват и днес. Прокариотите първоначално заемат много различни екологични ниши, които след това постепенно отстъпват място на еукариотите. Производство на различни различни видовеметаболизмът при прокариотите се дължи на проста структурна клетка, силно развита регулаторна система, бърз растеж и наличието на няколко механизма за трансфер на гени.
42.ПАТОГЕН МИКРООРГ И ИМУНИТЕТ.
Имунитетът ни предпазва от инфекциозни агенти: бактерии, вируси и протозои, т.е. предпазва организма от всичко чуждо.
Инфекцията е сложен биологичен процес, който възниква в резултат на проникването на патогенни микроби в тялото и нарушаване на постоянството на вътрешната му среда.
Патогенността е способността на микроб от определен вид при подходящи условия да причини характерно инфекциозно заболяване. Следователно патогенността е видова характеристика.
В естествената среда се срещат биологични замърсители, които причиняват различни заболявания при хората. Това са патогенни микроорганизми, вируси, хелминти и протозои. Те могат да бъдат намерени в атмосферата, водата, почвата и в тялото на други живи организми, включително самия човек.
Най-опасните патогени са инфекциозните заболявания. Имат различна стабилност в заобикаляща среда. Някои са способни да живеят извън човешкото тяло само няколко часа; намирайки се във въздуха, във водата, върху различни предмети, те бързо умират. Други могат да живеят в околната среда от няколко дни до няколко години. За други околната среда е тяхното естествено местообитание. За други други организми, като диви животни, осигуряват място за опазване и размножаване.
Често източникът на инфекция е почвата, в която постоянно живеят патогени на тетанус, ботулизъм, газова гангрена и някои гъбични заболявания. Те могат да попаднат в човешкото тяло, ако кожата е повредена, с немити храни или ако се нарушават хигиенните правила.
|
Типични антибиотици |
производители |
Кого засяга? |
Механизъм на действие |
Трудности при терапевтичната употреба |
|
Пеницилини, цефалоспорини |
Родове гъби Reницил, Цефалоспорум |
Грам-положителни и грам-отрицателни бактерии |
Нарушен синтез на клетъчната стена |
Алергични реакции |
|
Стрептомицин, гентамицин, канамицин, тобрамицин, амикацин |
Род актиномицети Streptomyces, родове бактерии Микромоноспора. Бацил lus |
Необратимо инхибиране на протеиновия синтез |
Токсичен ефект върху слуховия нерв и бъбреците |
|
|
Антибиотици със същото име |
Род актиномицети Streptomyces |
Грам-положителни и грам-отрицателни бактерии, рикетсии, хламидии, протозои |
Обратимо инхибиране на протеиновия синтез |
Разпространение на резистентни щамове |
|
Антибактериални: еритромицин Противогъбични и антипротозойни: полиени |
Род актиномицети Streptomyces Един и същ |
Грам-положителни бактерии Гъбички, някои протозои |
Разрушаване на плазмената мембрана |
Токсичност |
|
Полимиксини, грамицидини, бацитрацини |
Различни микроорганизми |
Основно грам-отрицателни бактерии |
Механизмът на действие е различен |
Висока токсичност |
микробна храносмилателна инфекция
Рекомбинацията е процес на обмяна на генетичен материал чрез разбиване и свързване на различни молекули. Рекомбинацията се случва, за да се поправят двуверижните разкъсвания в ДНК и да продължи репликацията, когато вилицата на репликация спре при еукариоти, бактерии и археи. Вирусите могат да се рекомбинират между РНК молекулите на своите геноми.
Рекомбинацията при еукариотите обикновено се случва по време на кросинговър по време на процеса на мейоза, особено по време на образуването на сперма и яйцеклетки при животни. Рекомбинацията, заедно с репликацията на ДНК, транскрипцията на РНК и транслацията на протеини, е една от основните, ранни хомоложни рекомбинации
Хомоложна рекомбинация
Класификация на видовете хомоложна рекомбинация: алелна, ектопична и хомеологична; реципрочни (кросингоувър) и нереципрочни (конверсия на ген).
Реципрочна рекомбинация. Ранни идеи за естеството на кросингоувъра: хипотезите за „прекъсване и свързване“ и „селективно копиране“. Експериментите на Meselson за доказване на механизма „счупи и съедини“. Разработване на методологични подходи за изследване на молекулярните механизми на рекомбинация. Два етапа на образуване на рекомбинантна ДНК: „съвместни“ и първични рекомбинантни молекули.
Генетичен контрол на хомоложната рекомбинация в бактериофагите. Червената система в бактериофага l. Екзонуклеаза l. система Orf. Бактериофаг Т4: ролята на гени 30, 32, 43, 46, 47, 49 и uvsX. Ензимология на рекомбинационните реакции: ендо- и екзонуклеази, ДНК полимераза, ДНК лигаза, UvsX протеин, SSB протеин и други протеини. Процеси на „разместване на нишка”, образуване на D-контур, „миграция на разклонения”, хетеродуплексна корекция. Основните етапи на кросинговъра са: пресинапсис, синапсис и постсинапсис. Модели на кросинговър при бактериофагите. Общото между процесите на рекомбинация и възстановяване на ДНК.
Основни модели на хомоложна рекомбинация. Холидей модел. Предпоставки на модела, същност, значение. Развитие на модела в последващи изследвания, негов сегашно състояние. Модел на Meselson-Reading. Модел на възстановяване на двуверижно разкъсване на ДНК (DSB) в дрожди (Zhostak et al.) по отношение на кръстосване и конверсия.
Рекомбинация по време на трансформация на хромозомна ДНК в бактерии. Параметри на рекомбинация. Размери на интегрирани донорни ДНК фрагменти. Кинетика и ефективност на трансформацията. Доказателство за интегриране на едноверижни фрагменти от донорна ДНК. Генетичен контрол и основни етапи на процеса на трансформация при Bacillus subtilis и Streptococcus pneumoniae. Комплекс донор-реципиент. Генетичен контрол и механизъм на рекомбинация по време на трансформация в Haemophilus influenzae. Трансформозома.
Рекомбинация по време на конюгация в Escherichia coli. Характеристики на конюгативния ДНК трансфер. Механизми на интегриране на донорна ДНК в хромозомата на реципиентната клетка.
Генетичен контрол на хомоложната рекомбинация в Е. coli. Гени, участващи в пресинапсиса: recA, recB, recC, recD, recE, recJ и др. Плейотропен ефект на мутациите recB и recC. ATP-зависима RecBCD нуклеаза, нейните дейности, механизми на действие и роли в различни генетични процеси. Chi сайт като гореща точка за рекомбинация. Универсалността на АТФ-зависимите нуклеази за бактерии. Гени, които контролират процеса на синапсис: recA, recF, recO, recR, ssb и др. Свойства на recA мутанти. RecA протеин, неговите характеристики. Реакции, катализирани от протеина RecA, неговата ключова роля в първите етапи на процеса на пресичане: пресинапсис и синапсис. Естеството на синапсиса по време на хомоложна рекомбинация. RecA ДНК филаменти, тяхната структура и функции при рекомбинация. Схема на кросинговър в Е. coli с участието на RecBCD нуклеаза и RecA протеин. RecA хомолози в други прокариотни и еукариотни организми. Ролята на SSB протеина. Постсинапсисни гени: ruvA, ruvB, ruvC, recG и техните продукти. Роля в миграцията на хемихиазмата на Холидей и нейното разрешаване.
Супресорни мутации sbcA, sbcB, sbcC и sbcD. Екзонуклеази I и VIII. SbcCD нуклеаза. Три пътя на рекомбинация на хромозомна ДНК в E. coli K-12 според Clark: RecBCD, RecF и RecE, техните характеристики. Ролята на пътищата RecF и RecE в хомоложната рекомбинация на плазмиди.
Характеристики на процеса на кросинговър при еукариоти. Мейотичен кросингоувър. Ролята на синаптонемния комплекс. Генетичен контрол на мейотичната рекомбинация. Разнообразие от RecA-подобни протеини (рекомбинази) в еукариоти.
Митотичен кросингоувър: връзката между реципрочна и нереципрочна рекомбинация. Преминаване в G1 клетки. Разлики в генетичния контрол на мейотичния и митотичния кросингоувър в дрождите Saccharomyces.
Рекомбинационни горещи точки в еукариотите. Ролята на ДНК DNR в инициирането на мейотичен и митотичен кросингоувър.
Рекомбинантно възстановяване на DNRs в хромозомна и плазмидна ДНК в дрожди. Генетичен контрол и разнообразие от механизми: модел на Жостак и др. и неговите модификации, механизми на „разкъсване и копиране“, „отгряване на комплементарни ДНК вериги“ („единично верижно отгряване“), „хомоложно-зависимо лигиране“.
Ектопична рекомбинация, нейният генетичен контрол, молекулярни механизми и биологично значение.
Конверсия на ген (корекция на рекомбинационен хетеродуплекс). Нереципрочност на интрагенната рекомбинация. Хипотеза за корекция на несдвоената база (Халидей). Генетичен контрол и пътища за коригиране на хетеродуплекси в E.coli. Системи за ремонт на несдвоени бази с образуване и изграждане на разширени празнини в хетеродуплекса. Mut HLSU система, нейните характеристики. Молекулярен модел на хетеродуплексна корекция, включваща системата MutHLSU. Еволюционно запазване на протеините MutL и MutS. Ролята на MutL и MutS протеините в процесите на корекция на несдвоени бази и в регулирането на хомеологичната рекомбинация. Системи за коригиране на несдвоени бази в E.coli с образуване и изграждане на къси празнини. Корекция на хетеродуплекси по време на бактериална трансформация, нейния генетичен контрол (Hex система), влияние върху резултатите от генетичното картиране. Корекция и висока отрицателна намеса.
Генна конверсия при еукариоти. Тетраден анализ на междуалелни кръстове. Видове тетрадки. Полярност на преобразуването, причините за това. Коконверсия. Дължина на секцията за преобразуване. Въпросът за връзката между мейотичната конверсия и реципрочната рекомбинация на странични маркери. Митотична алелна генна конверсия. Ектопична мейотична и митотична конверсия. Превключване на MAT локуси в хомоталови дрожди. Генетичен контрол на генната конверсия при екариоти, използвайки примерите на дрожди и хора. Еукариотни хомолози на бактериални протеини MutL и MutS - семейства протеини PMS, MHL, MHS и др., техните функции в рекомбинация и други клетъчни процеси. Сложността на системите за коригиране на несъответствието в еукариотите, базирана на участието на различни хомолози на бактериални протеини MutL и MutS.
Ролята на конверсията в еволюцията и онтогенезата. Връзката между процесите на кросинговър и конверсия в различни генетични системи. Процеси на преобразуване, които протичат независимо от кросингоувъра.
Рекомбинационни процеси, които не изискват хомология за синапсис
Сайт-специфична рекомбинация. Разпределение на сайт-специфични системи за рекомбинация при прокариоти и еукариоти, техните функции. Сайт-специфични топоизомерази тип I като ключови протеини на сайт-специфична рекомбинация в бактериофаги, бактерии и дрожди. Две семейства на сайт-специфични топоизомерази I са интегрази и резолвази.
Сайт-специфична рекомбинация по време на интегриране и изрязване на фаг l. Схемата на Кембъл. Разлики между генетичните карти на вегетативния фаг и профага. Структура на сайтовете attP и attB. Система Int. Int протеин като представител на семейството на интегразите. Е. coli IHF протеин. Интасома. Молекулярен модел на интегриране и изрязване на фаг l. Антипаралелно подравняване на att сайтове по време на синапсис. Природата на синапсиса по време на специфична за сайта рекомбинация.
Сайт-специфични ДНК инверсии в бактериофаги и бактерии (Din система) и в дрожди. Ключови рекомбинантни протеини са инвертазите като представители на семейството на резолвазите. Подобрители на рекомбинация за специфични за сайта инверсии. Е. coli Fis протеин. Инвертазома. Молекулен модел на рекомбинация, извършена от резолвази. Ролята на сайт-специфичните инверсии в регулирането на генната експресия.
Транспониране на мобилни генетични елементи. Транспозиции при прокариотите. Мобилни генетични елементи: IS елементи, транспозони (Tn), Mu фаг. Структура на подвижните елементи. Функции, управлявани от различни движещи се елементи. Транспозаза. Участие на протеини на клетка гостоприемник в транспониране. Въпросът за спецификата на интегриране на мобилния елемент в целевата ДНК. Общостта на реакциите, които съставляват процесите на транспониране в различни видове мобилни елементи на прокариоти и еукариоти.
Генетична организация на прости транспозони от семейството Tn3. Гени tnpA и tnpR, техните продукти. Репликативна транспозиция, два етапа на процеса. Молекулярният модел на Шапиро. Генетичен контрол и молекулярен механизъм на нерепликативно транспониране в сложни транспозони Tn5, Tn9 и Tn10. Генетичен контрол и механизми на транспониране във фаг Mu. Транспозома.
Конюгативни транспозони на грам-положителни и грам-отрицателни бактерии, тяхната класификация. Генетичен контрол и механизми на транспозиция. Биологично значение.
Подвижни генетични елементи на еукариоти (дрожди, растения, дрозофила, бозайници). Класификация на еукариотните подвижни елементи. Елементи с прокариотен тип структура. Ретротранспозони тип I при дрожди, растения и животни, тяхната структура, генетичен контрол и механизъм на транспониране, класификация. Ретротранспозони тип II: структурни особености, разпространение, механизъм на транспониране.
Генетични ефекти, причинени от преносими елементи в прокариоти и еукариоти: промени в генната експресия, генни мутации, хромозомни пренареждания, хибридна дисгенеза. Участие на подвижните елементи в организацията на хромозомната структура. Роля в онтогенезата на живите организми и в еволюцията на генетичния материал. Мобилните елементи като инструмент за генетични изследвания.
Незаконна рекомбинация. Диапазонът от явления, приписвани на незаконната рекомбинация. Нехомоложна рекомбинация в бактерии, катализирана от ДНК гираза. Молекулен модел (Ikeda). Нехомоложна рекомбинация, включваща ДНК-зависима протеин киназа при гръбначни животни. Роля в възстановяването на двойноверижни скъсвания, интегриране на екзогенна ДНК в хромозоми и пренареждане на имуноглобулинови ДНК последователности.
Програмирани рекомбинационни пренареждания на генетичен материал в онтогенезата
Свързване на несвързани части от гени с помощта на сайт-специфична рекомбинация по време на спорулация в Bacillus subtilis и по време на образуването на хетероцисти във филаментозни цианобактерии. Пренареждане на генетичен материал по време на образуването на макронуклеус в ресничестите реснички. Намаляване на хроматина при редица представители на безгръбначните.
Сайт-специфична рекомбинация при гръбначни животни, участващи в пренареждане на имуноглобулинови ДНК последователности. Структура на имуноглобулиновите молекули. Организация и структура на ДНК последователности, участващи в образуването на гени, кодиращи имуноглобулини. Ролята на генните продукти RAG1 и RAG2. Механизмът на сайт-специфична рекомбинация по време на свързването на кодиращи сегменти на имуноглобулинови гени. Участие на други генетични процеси в образуването на имуноглобулинови гени: хомоложна рекомбинация (ектопичен митотичен кросинговър, ектопична митотична конверсия), нелегална рекомбинация, хипермутагенеза, алтернативен сплайсинг. Свързването на тези процеси с определени етапи на диференциация на В-лимфоцитите.
Трансформацията е процес на усвояване от клетка на организъм на свободна ДНК молекула от околната среда и нейното интегриране в генома, което води до появата в такава клетка на нови наследствени характеристики, характерни за организма на донора на ДНК. Понякога трансформацията се разбира като всеки процес на хоризонтален генен трансфер, включително трансдукция, конюгация и т.н.
Трансформация на прокариоти
Във всяка популация само част от бактериите са способни да абсорбират ДНК молекули от околната среда. Състоянието на клетките, в което това е възможно, се нарича състояние на компетентност. Обикновено максималният брой компетентни клетки се наблюдава в края на фазата на логаритмичен растеж.
В състояние на компетентност бактериите произвеждат специален нискомолекулен протеин (фактор на компетентност), който активира синтеза на автолизин, ендонуклеаза I и ДНК-свързващ протеин. Автолизинът частично разрушава клетъчната стена, което позволява на ДНК да премине през нея, а също така намалява устойчивостта на бактериите към осмотичен шок. В състояние на компетентност общата скорост на метаболизма също намалява. Възможно е изкуствено да се приведат клетките в състояние на компетентност. За целта медии с високо съдържаниекалциеви, цезиеви, рубидиеви йони, електропорация или замяна на реципиентните клетки с протопласти без клетъчни стени.
Ефективността на трансформацията се определя от броя на колониите, отгледани върху петриево блюдо след добавяне на 1 μg суперспирална плазмидна ДНК към клетките и посяване на клетките върху хранителна среда. Съвременни методипозволяват постигане на ефективност 106--109.
Абсорбираната ДНК трябва да бъде двуверижна (ефективността на трансформация на едноверижна ДНК е с порядъци по-ниска, но леко се увеличава в кисела среда), нейната дължина трябва да бъде най-малко 450 базови двойки. Оптималното pH за процеса е около 7. За някои бактерии (Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus) абсорбираната ДНК трябва да съдържа определени последователности.
ДНК се адсорбира необратимо върху ДНК-свързващ протеин, след което една от нишките се нарязва от ендонуклеаза на фрагменти с дължина 2-4 хиляди базови двойки и прониква в клетката, втората е напълно унищожена. Ако тези фрагменти имат висока степен на хомология с някои участъци от бактериалната хромозома, е възможно тези участъци да бъдат заменени с тях. Следователно ефективността на трансформацията зависи от еволюционното разстояние между донора и реципиента. Общото време на процеса не надвишава няколко минути. Впоследствие при разделянето на един дъщерна клеткаДНК, изградена на базата на оригиналната ДНК верига, влиза в друга - на базата на верига с включен чужд фрагмент (разцепване)
Трансформация на еукариотни клетки с помощта на синтетични полимерни катиони
Доставяне на чужди нуклеинови киселини в непокътнати клетки, илитрансформацията е в основата на много методи на генното инженерство. Транспортът на функционални гени в тъканите може да направи възможна корекциягенен дефицит и мутации, които водят до тежки наследствени патологии или рак. Понастоящем са разработени редица техники за въвеждане на ДНК в клетките, сред които най-често срещаните са утаяване с калциев фосфат или диетиламиноетил-декстран (DEAE-декстран), електропорация, микроинжектиране, вграждане на ДНК в реконструираната обвивка на вируси или липозоми ( липидни везикули с изкуствена мембрана).
Въпреки многообразието на тези методи, търсенето на нови начини за трансформиране на про- и еукариотни клетки продължава. От една страна, това се дължи на необходимостта от повишаване на ефективността на трансформацията; от друга страна, изброените по-горе методи са приложими само за ограничен брой клетъчни линии и са неефективни при опит за въвеждане на РНК в клетките. И накрая, повечето от тези подходи не могат да се използват за in vivo генетична трансформация.
Като ДНК носители се използват ретровирусни вектори, вектори на базата на ДНК-съдържащи вируси и HIV, липозоми на базата на катионни липиди и полимерни ДНК-свързващи катиони. Използването на синтетични полимери като ДНК носители има редица предимства: лесно съхранение и пречистване, лесно тестване за токсичност и безопасност и, най-важното, за генна терапия, намалявайки риска от патогенетични и имунологични усложнения.
При смесване на разтвори на линейни поликатиони и ДНК се образуват интерполиелектролитни комплекси (IPECs) поради образуването на кооперативна система от междуверижни електростатични връзки. В този случай поликатионните вериги обграждат ДНК молекулата, образувайки сфери или тороиди, в зависимост от вида на полимера. Включването в IPEC води до уплътняване на ДНК, повишава устойчивостта й към действието на нуклеазите, засилва взаимодействието й с клетъчната мембрана и повишава трансформиращата активност по отношение както на прокариотните, така и на еукариотните клетки. Чрез комбиниране на поликатионни молекули с лиганди, способни на специфично свързване към клетъчната мембрана, е възможно да се осигури проникването на IPEC в клетката през рецепторния път, а в тялото - целенасочена доставка до целевите клетки.
Системите за доставка на ДНК за използване в генната терапия трябва да осигурят проникване на ДНК в желания орган, тъкан или специфична група клетки и след това в клетъчното ядро. Антисенс олигонуклеотидите, които са най-често използваните в генната терапия, трябва да намерят иРНК или региона на хромозомна ДНК, срещу който са насочени. Въведеният ген трябва да бъде част от конструкт, способен да го експресира.
Това обаче е доста сложен проблем. Когато нуклеинова киселина или олигонуклеотид се въведе в тялото, те няма да стигнат предимно до желаната тъкан или орган, а частта, която завършва в на точното място, само в малка степен ще могат да преминат през хидрофобната клетъчна мембрана. Освен това по време на еволюцията са разработени механизми за защита на телесните клетки от нахлуващи фактори. външна среда, включително чужда ДНК. Веднъж попаднала в клетката, чуждата ДНК може да не се локализира там, където е необходима, и освен това може да попадне в лизозомите, където да бъде унищожена от нуклеази.
Проникването в клетката и вътреклетъчния транспорт на IPEC възниква, вероятно, поради образуването и последователното разрушаване на ендозоми. На всеки етап от този процес значителна част от материала се губи. Оскъдното освобождаване на вектори от ендозоми в цитоплазмата и техният неефективен транспорт в ядрото водят до ниска ефективност на трансгенната експресия.
Рестрикционна карта на плазмид pBR 322:
числата показват номерирането на нуклеотидите;
тънки линии - единични места, разпознати от рестрикционните ензими;
дебели сиви стрелки отгоре - посока на транскрипция;
Pbla - Ampr генен промотор - резистентност към ампицилин;
Ptet - Tetr генен промотор - резистентност към тетрациклин;
TT1 - Rho-независим терминатор на транскрипция (позиция 3140-3160); TT2 - позиция 3080-3110; ROP е протеин, който насърчава образуването на дуплекси между РНК 1 и РНК 2 (отрицателен регулатор на броя на копията); РНК 1 - контролна РНК (контролира броя на копията на плазмида); РНК 2 - "праймер" РНК (служи като праймер за репликация); дебели черни стрелки - посока на транскрипция на РНК 1 и РНК 2
Вектори, базирани на М13 фаг
Има три начина за повишаване на ефективността на трансфера на ДНК в еукариотни клетки с помощта на синтетични поликатиони. Първо, повишава специфичността на трансфекцията поради лиганди, свързани с поликатионна молекула и осигуряване на селективно взаимодействие на комплекси с клетки от определен фенотип. Второ, повишаване на ефективността на трансформацията поради селекцията на гени или олигонуклеотиди, въведени в клетката. Трето, увеличаване на честотата на трансфекция, което се постига чрез използването на лиганди, които взаимодействат по-ефективно с клетъчната мембрана, и вещества, които дестабилизират мембраната. Освен това е възможен синтез на нови поликатиони.
Лабораторията по молекулярна вирусология и генно инженерство на Института за изследване на грипа към Руската академия на медицинските науки в Санкт Петербург изучава начини за доставяне на ДНК и вирусни частици в клетките. Тази работа използва набор от полимерни подложки, синтезирани от служители на Института по макромолекулни съединения на Руската академия на науките. Следните плазмиди бяха използвани като експресионни вектори: pUC 18, съдържащ цитомегаловирусния промотор и b-галактозидазния ген, и pBR 322, съдържащ цитомегаловирусния промотор и алгалнозеления флуоресцентен протеинов ген.
В резултат на проучванията беше установено, че поли-(2-(диметиламино)етил)метакрилат (PDMAEMA) IPECs с ниско молекулно тегло имат най-голяма трансфекционна активност. По-нататъшните изследвания ще ни позволят да разработим нови подходи за решаване на текущи проблеми във вирусологията, молекулярната и клетъчна биология, генно инженерство, генна терапия.
Трансдукцията (от латински transductio - движение) е процес на прехвърляне на бактериална ДНК от една клетка в друга от бактериофаг. Общата трансдукция се използва в бактериалната генетика за геномно картографиране и щамово инженерство. Както умерените, така и вирулентните фаги са способни на трансдукция; последните обаче унищожават бактериалната популация, така че трансдукцията с тяхна помощ не е от голямо значение нито в природата, нито в изследванията.
Обща (неспецифична) трансдукция
Осъществява се от фаг P1, който съществува в бактериалната клетка под формата на плазмид, и от фаги P22 и Mu, които се интегрират във всяка част от бактериалната хромозома. След индукция на профаг, с вероятност от 10?5 на клетка, е възможно погрешно опаковане на бактериален ДНК фрагмент във фаговия капсид; в този случай в него няма фагова ДНК. Дължината на този фрагмент е равна на дължината на ДНК на нормалния фаг, неговият произход може да бъде всичко: произволна част от хромозомата, плазмид, други умерени фаги.
Веднъж попаднал в друга бактериална клетка, фрагмент от ДНК може да бъде включен в нейния геном, обикновено чрез хомоложна рекомбинация. Плазмидите, прехвърлени от фага, могат да се затворят в пръстен и да се репликират вече вътре нова клетка. В някои случаи ДНК фрагмент не е интегриран в реципиентната хромозома и не се репликира, а се съхранява в клетката и се транскрибира. Това явление се нарича абортивна трансдукция.
Специфична трансдукция
Специфичната трансдукция е най-добре проучена с помощта на примера на фаг L. Този фаг е интегриран само в една област (att-сайт) на хромозомата на Е. coli със специфична нуклеотидна последователност (хомоложна на att-мястото в ДНК на фага). По време на индукцията изключването му може да възникне с грешка (вероятност 10?3--10?5 на клетка): изрязва се фрагмент със същия размер като ДНК на фага, но с начало на грешното място. В този случай някои от гените на фага се губят и някои от гените на E. coli се улавят от него. Вероятността за трансфер на ген в този случай намалява с увеличаване на разстоянието от него до мястото на att.
Всеки умерен фаг, специално интегриран в хромозомата, се характеризира със собствено място att и съответно гените, разположени до него, които е способен да предава. Редица фаги могат да се интегрират във всяко място на хромозомата и да прехвърлят всякакви гени чрез специфичен механизъм на трансдукция. В допълнение, хромозомата обикновено съдържа последователности, които са частично хомоложни на att региона на ДНК на фага. Ако напълно хомоложно att място е повредено, е възможно да се постигне включването на фага в хромозомата по тези последователности и трансфер на гени, съседни на тях по време на специфична трансдукция.
Когато умерен фаг, носещ бактериални гени, се интегрира в хромозомата на нова бактерия гостоприемник, той вече съдържа два идентични гена - собствения си и тези, донесени отвън. Тъй като фагът няма част от собствените си гени, той често не може да бъде индуциран и възпроизведен. Въпреки това, когато същата клетка е заразена с „помощен“ фаг от същия вид, индукцията на дефектен фаг става възможна. Както ДНК на нормалния фаг „помощник“, така и ДНК на дефектния фаг излизат от хромозомата и се репликират, заедно с бактериалните гени, които носи. Следователно около 50% от получените фагови частици носят бактериална ДНК. Това явление се нарича високочестотна трансдукция (HFT).
Конюгация (от латински conjugatio - връзка), парасексуален процес - еднопосочен трансфер на част от генетичния материал (плазмиди, бактериална хромозома) чрез директен контакт на две бактериални клетки. Открит през 1946 г. от J. Lederberg и E. Taitem. Той е от голямо значение в природата, защото насърчава обмена на полезни свойства при липса на истински полов процес. От всички процеси на хоризонтален трансфер на гени, конюгацията позволява трансфер на най-голямо количество генетична информация.
Механизъм
За да се установи успешно контакт между две клетки, в донорната клетка трябва да присъства конюгативен (полов, трансмисивен) плазмид. Първият от тях беше откриването на F-плазмида: епизома (способен да се интегрира в бактериалната хромозома), дълъг около 100 хиляди базови двойки. Плазмидът носи гени, кодиращи редица функции. Един от тях е образуването на полови пили, които са отговорни за адхезията към реципиентната клетка.
Конюгативните плазмиди също кодират протеини, които предотвратяват прикрепването на пили на други бактерии към клетъчната стена на дадена. Следователно клетките, които вече съдържат трансмисивни плазмиди, са с няколко порядъка по-малко вероятно да действат като реципиенти за конюгация.
Плазмидът кодира ендонуклеаза, която прекъсва една от веригите на неговата ДНК в определена точка (oriT). След това отрязаната нишка се развива и 5-инчовият край се прехвърля в реципиентната клетка. Предполага се, че ДНК се прехвърля през канали в половите пили, но сега е доказано, че прехвърлянето става през порите в клетъчната стена. първият сегмент от нишката, влизащ в клетката реципиент В ДНК се намират антирестрикционни гени, които трябва да бъдат транскрибирани в реципиента веднага след пристигането им там, за да се осигури натрупването на протеини, които блокират процеса на разрушаване на ДНК от рестрикционни ензими Накрая прехвърлената верига се затваря в пръстен и на нейна основа се възстановява двуверижната структура на плазмидната ДНК.Целият процес продължава няколко минути.
Конюгативният плазмид може да бъде интегриран в хромозомата чрез хомоложна рекомбинация, включваща IS елементи. Конюгацията следва същия механизъм, но не само плазмидът се прехвърля към реципиента, но и хромозомният материал на донора. В този случай процесът се проточва с часове, а предаваната ДНК верига често се къса. Чрез изкуствено спиране на трансфера на ДНК към различно времеи наблюдавайки кои гени са прехвърлени, е получена карта на хромозомата на E. coli и е показана нейната пръстенна структура.
Когато се отцепи от хромозома, плазмидът може да улови нейния фрагмент и да го прехвърли със себе си в друга клетка (аналогия с трансдукцията). Този процес се нарича сексдукция.
Някои малки плазмиди, наречени мобилизируеми плазмиди, могат да бъдат прехвърлени по време на конюгиране, като се използва „помощният“ апарат за трансмисивен плазмиден трансфер. За да направят това, те трябва да съдържат последователности, подобни на oriT на конюгативния плазмид и разпознати от неговите ендонуклеази.