Лаборатория по наследствени метаболитни болестие създадена в Медицинския генетичен научен центърпреди повече от 30 години. Първата работа в лабораторията е свързана с разработването на тестове за откриване на фенилкетонурия и програми за селективен скрининг наследствени заболяванияметаболизъм (NBO). Постепенно лабораторията преминава към използването на комплексни биохимични и молекулярно-генетични методи за точна диагностика на наследствени заболявания. Именно тук, под ръководството на професор Ксения Дмитриевна Краснополская, са разработени подходи за биохимична диагностика на заболявания на клетъчните органели. Днес това е единствената лаборатория в Русия, където се извършва постнатална и пренатална диагностика на по-голямата част от заболяванията от тази група.

Един от научни направленияРаботата на звеното е търсенето на нови биохимични маркери за наследствени заболявания, разработването на нови методи за тяхната ефективна диагностика.

Гамата от биохимични методи, използвани в лабораторията, е изключително широка и включва: електрофореза на гликозаминогликани в урината, изоелектрично фокусиране на трансферини, хромато-масспектрометрия, високоефективна течна хроматография, анализ на активността на лизозомни и митохондриални ензими с помощта на хромогенни и флуорогенни субстрати , окисление. Някои форми на НБО, неоткривани досега у нас, са диагностицирани лабораторно за първи път.

Значителен пробив в диагностиката на НБО беше въвеждането на метода на тандемната масспектрометрия, който позволява да се идентифицират около 30 форми на наследствени заболявания от групите на най-често срещаните НБО в микроколичества биологичен материал (петно ​​от засъхнала кръв или плазма): аминоацидопатии, органични ацидурии и дефекти в митохондриалното β-окисление.

През последните години молекулярно-генетичните методи се развиват активно в лабораторни условия. За някои заболявания от групата на НБО са създадени протоколи за ДНК диагностика, за да се намали времето за диагностика и да се избегне използването на трудоемки и инвазивни биохимични методи. От 2015 г. лабораторията използва секвениране от следващо поколение за анализ на множество гени едновременно. Такива панели са разработени за митохондриални заболявания, наследствени заболявания с преобладаващо увреждане на черния дроб, левкодистрофии/левкоенцефалопатии.

Днес използваните биохимични и молекулярно-генетични методи позволяват да се диагностицират повече от 200 различни форми на наследствени метаболитни заболявания.

Лабораторията работи за характеризиране на спектъра и честотата на мутациите при наследствени мукополизахаридози, сфинголипидози, невронални цероидни липофусцинози и разработване на алгоритми за диагностициране на заболявания, протичащи с увреждане на бялото вещество на мозъка, както и други наследствени неврометаболитни нарушения.

Описание

Подготовка

Показания

Тълкуване на резултатите

Документи за попълване

Описание

Метод за определяне

Тандемна масспектрометрия с йонизация с електроспрей.

Проучван материал Капилярна кръв, събрана на специална филтърна карта № 903

Анализ на спектъра на аминокиселини и ацилкарнитини с помощта на тандемна масспектрометрия (TMS)

Какво представляват метаболитните нарушения? Наследствените метаболитни нарушения, или с други думи, метаболизъм, са около 500 различни заболявания, които се причиняват от нарушаване на функционирането на специални биохимични катализатори - ензими. Ензимите осигуряват процеси за разграждане на аминокиселини, органични киселини, мастни киселинии други биомолекули. Много хора погрешно смятат, че тъй като заболяванията от тази група са изключително редки, те трябва да бъдат изключени като последна мярка. Но според литературата* едно на 3000 новородени страда от наследствени метаболитни нарушения!

Специално място сред тези заболявания заемат заболяванията, които започват рано детство. Тези заболявания често се комбинират с тежка неонатална патология и/или протичат под прикритието на състояния като сепсис, перинатална лезия нервна система, вътрематочна инфекция. Късното откриване на заболявания от тази група може да доведе до тежка инвалидност или дори фатален изход. Установено е, че 5%** от всички случаи на „синдром внезапна смърткърмачета“ е следствие от наследствени метаболитни нарушения. Въпреки това, някои от тези заболявания могат да бъдат ефективно лекувани, ако бъдат диагностицирани навреме. Един от съвременните методи за диагностика на метаболитни нарушения е тандемната масспектрометрия (TMS). Този метод ви позволява да определите малко количество биологичен материал (капка суха кръв), което ви позволява да подозирате наследствено заболяване с определена вероятност. В някои страни този метод изследва всички новородени за 10-30 наследствени метаболитни нарушения. С други думи, всички новородени се подлагат на специално биохимично изследване, наречено скрининг. * Вилариньо Л, Роча Х, Соуса С, Марко А, Фонсека Х, Богас М, Осорио РВ. Четири години разширен скрининг на новородени в Португалия с тандемна масспектрометрия. J Наследяване на Metab Dis. 2010, 23 февруари ** Olpin SE Метаболитно изследване на внезапна детска смърт. Ann Clin Biochem, 2004, 41 юли (Pt4), 282-293 **Opdal SH, Rognum TO Генът на синдрома на внезапната детска смърт: съществува ли? Педиатрия, 2004, V.114, N.4, pp. e506-e512 Какво е скрининг? Скринингът (от английски Screening - пресяване) е масов преглед на пациенти за идентифициране на различни заболявания, ранна диагностикакоето помага да се предотврати развитието на тежки усложнения и увреждане. За какви заболявания се прави задължителен скрининг на новородените у нас? В Русия има държавна програма, която включва задължително изследване (скрининг) на всички новородени само за 5 наследствени заболявания: фенилкетонурия (PKU), кистозна фиброза, галактоземия, адреногенитален синдром и вроден хипотиреоидизъм.

Обръщаме внимание на факта, че от този списък изследването „HEEL“ включва само скрининг за фенилкетонурия (за пълен списък на наследствени метаболитни заболявания, открити чрез скрининга „HEEL“, вижте по-долу в текста).

За какви заболявания може допълнително да се изследва детето? Понастоящем в Русия не се извършва скрининг на новородени, насочен към диагностициране на метаболитни нарушения с помощта на TMS. В Русия това изследване все още се извършва по лекарско предписание, ако има съмнения за наследствени метаболитни заболявания, въпреки че много от заболяванията от тази група не се проявяват веднага след раждането, но вече присъстват при новороденото. Въпреки това, използвайки споменатия по-горе метод на тандемна масспектрометрия (TMS), е възможно допълнително да се изследва новородено дете, за да се изключат 37 различни наследствени заболявания, които се отнасят до нарушения на метаболизма на аминокиселини, органични киселини и дефекти в ß-окислението на мастни киселини. Аминоацидопатията Аминоацидопатията се развива поради липса на специфични ензими, необходими за метаболизма на аминокиселините. Това води до ненормално високо нивоаминокиселини и техните производни в кръвта и урината, които имат токсичен ефект върху клетките и тъканите на тялото. Основни симптоми: изоставане в развитието, конвулсии, кома, повръщане, диария, необичайна миризма на урина, зрителни и слухови увреждания. Лечението се състои в предписване специална диетаи витамини. Ефективността на терапията зависи от това колко рано и точно е поставена диагнозата. За съжаление, някои заболявания от тази група не могат да бъдат лекувани. Органична ацидурия/ацидемия Органичната ацидурия/ацидемия е резултат от нарушено химично разграждане на аминокиселини поради недостатъчна ензимна активност. Техен клинични проявленияподобни на проявите на аминоацидопатията. Лечението се състои в предписване на специална диета и/или витамини. За съжаление, някои заболявания от тази група не могат да бъдат лекувани. Дефекти в ß-окислението на мастните киселини ß-окислението на мастните киселини е многоетапен процес на тяхното разграждане, в резултат на което се генерира енергията, необходима за живота на клетката. Всяка стъпка от процеса на окисляване се извършва от специфични ензими. Ако някой от ензимите липсва, процесът се нарушава. Симптоми: сънливост, кома, повръщане, ниско нивокръвна захар, увреждане на черния дроб, сърцето, мускулите. Лечението се състои в предписване на диета с ниско съдържание на мазнини с често и разделно хранене, други специализирани диетични продукти, както и левокарнитин. Пълен списък на идентифицираните наследствени метаболитни заболявания

1. Болест на урината с мирис на кленов сироп (левциноза).
2. Цитрулинемия тип 1, неонатална цитрулинемия.
3. Аргининосукцинова ацидурия (ASA)/дефицит на аргининосукцинат лиаза лиаза.
4. Дефицит на орнитин транскарбамилаза.
5. Дефицит на карбамил фосфат синтаза.
6. Дефицит на N-ацетилглутамат синтаза.
7. Некетотична хиперглицинемия.
8. Тирозинемия тип 1.
9. Тирозинемия тип 2.
10. Хомоцистинурия/дефицит на цистатионин бета синтетаза.
11. Фенилкетонурия.
12. Аргининемия/дефицит на аргиназа.
13. Пропионова ацидемия (дефицит на пропионил КоА карбоксилаза).
14. Метилмалонова ацидемия.
15. Изовалерианова ацидемия (дефицит на изовалерил КоА дехидрогеназа).
16. Дефицит на 2-метилбутирил КоА дехидрогеназа.
17. Дефицит на изобутирил КоА дехидрогеназа.
18. Глутарова ацидемия тип 1 (дефицит на глутарил КоА дехидрогеназа тип 1).
19. Дефицит на 3-метилкротонил КоА карбоксилаза.
20. Дефицит на множествена карбоксилаза.
21. Дефицит на биотинидаза.
22. Малонова ацидемия (дефицит на малонил КоА декарбоксилаза).
23. Дефицит на митохондриална ацетоацетил КоА тиолаза.
24. Дефицит на 2-метил-3-хидроксибутирил КоА дехидрогеназа.
25. Дефицит на 3-хидрокси-3-метилглутарил CoA лиаза.
26. Дефицит на 3-метилглутаконил КоА хидратаза.
27. Дефицит на средноверижна ацил-КоА дехидрогеназа.
28. Дефицит на ацил-КоА дехидрогеназа с много дълга верига.
29. Дефицит на късоверижна ацил-КоА дехидрогеназа.
30. Дефицит на дълговерижна 3-хидроксиацил-CoA дехидрогеназа (дефект на трифункционален протеин).
31. Глутарова ацидемия тип II (глутарил КоА дехидрогеназен дефицит тип II), множествен ацил-КоА дехидрогеназен дефицит.
32. Нарушен транспорт на карнитин.
33. Дефицит на карнитин палмитоил трансфераза тип I.
34. Дефицит на карнитин палмитоил трансфераза тип II.
35. Дефицит на карнитин/ацилкарнитин транслоказа.
36. Дефицит на 2,4-диеноил КоА редуктаза.
37. Дефицит на средноверижна 3-кетоацил-КоА тиолаза.
38. Дефицит на ацил-КоА дехидрогеназа със средна/къса верига.

Материал за изследване: капилярна кръв, събрани на специална филтърна карта No903.

Литература

1. Chace D.H., Kalas T.A., Naylor E.W. Приложението на тандемна масспектрометрия за неонатален скрининг за наследствени нарушения на междинния метаболизъм. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2002 г.; об. 3; стр. 17-45.
2. Leonard J.V., Dezateux C. Скрининг за наследствени метаболитни заболявания при новородени с помощта на тандемна масспектрометрия. BMJ. 2002 г.; об. 324 (7328); стр. 4-5.
3. Millington D., Kodo N., Terada N., Roe D., Chace D. Анализът на диагностичните маркери на генетични нарушения в човешката кръв и урина с помощта на тандемна масспектрометрия с течна вторична йонна масспектрометрия. 1991 Int.J.Mass Spectr .Йонен процес. 111:211-28.
4. Чейс Д.Х. Масспектрометрия в клинична лаборатория. Chem Rev. 2001 февруари; 101 (2): 445-77.
5. Duran M., Ketting D., Dorland L., Wadman S.K. Идентифициране на ацилкарнитини чрез десорбционна химическа йонизационна масспектрометрия. J Наследяване на Metab Dis. 1985; 8 Допълнение 2: 143-4.
6. Millington D.S., Kodo N., Norwood D.L., Roe C.R. Тандемна масспектрометрия: нов метод за профилиране на ацилкарнитин с потенциал за неонатален скрининг за вродени грешки на метаболизма. J Наследяване на Metab Dis. 1990;13(3):321-4.
7. Chace D.H., DiPerna J.C., Mitchell B.L., Sgroi B., Hofman L.F., Naylor E.W. Електроспрей тандемна масспектрометрия за анализ на ацилкарнитини в изсушени постмортални кръвни проби, събрани при аутопсия от бебета с необяснима причина за смъртта. Clin Chem. 2001;47(7):1166-82.
8. Rashed M.S., Bucknall M.P., Little D., Awad A., Jacob M., Alamoudi M., Alwattar M., Ozand P.T. Скрининг на кръвни петна за вродени грешки на метаболизма чрез електроспрей тандемна масспектрометрия с партиден процес на микроплака и компютърен алгоритъм за автоматизирано маркиране на анормални профили. Clin Chem. юли 1997 г.; 43(7):1129-41.
9. Millington D.S., Terada N., Chace D.H., Chen Y.T., Ding J.H., Kodo N., Roe C.R. Ролята на тандемната масспектрометрия в диагностиката на нарушения на окисляването на мастни киселини. Prog Clin Biol Res. 1992 г.; 375:339-54.
10. Rashed M.S., Ozan P.T., Harrison ME, Watkins P.J.F., Evans S. 1994. Електроспрей тандемна масспектрометрия при анализа на органични ацидемии. Бърза Комун. Масов спектър. 8:122-33
11. Vreken P., van Lint A.E., Bootsma A.H., Overmars H., Wanders R.J., van Gennip A.H. Бърза диагностика на органични ацидемии и дефекти на окисление на мастни киселини чрез количествен електроспрей тандем-MS анализ на ацил-карнитин в плазма. Adv Exp Med Biol. 1999 г.; 466:327-37.
12. Griffiths W.J., Jonsson A.P., Liu S., Rai D.K., Wang Y. Electrospray и тандемна масспектрометрия в биохимията. Biochem J. 2001 1 май; 355 (Pt 3): 545-61.
13. Дули К.С. Тандемна масспектрометрия в лабораторията по клинична химия. Clin Biochem. 2003 септември; 36(6):471-81.
14. Михайлова С.В., Илиина Е.С., Захарова Е.Ю., Байдакова Г.В., Бембеева Р.Ц., Шехтер О.В., Захаров С.Ф. „Множествен дефицит на карбоксилаза, причинен от мутации в гена на биотинидазата // Медицинска генетика. - 2005. - № 2. - стр. 633-638.
15. Байдакова Г.В., Букина А.М., Гончаров В.М., Шехтер О.В., Букина Т.М., Покровская А.Я., Захарова Е.Ю., Михайлова С.В., Федонюк И Л.Д., Колпакчи Л.М., Семикина Л.И., Илиина Е.С. Диагностика на наследствени метаболитни заболявания на базата на комбинация от тандемни масспектрометрични и ензимни диагностични методи, Медицинска генетика, 2005, том 4, № 1, с. 28-33.
16. Захарова Е.Ю., Илиина Е.С., Букина А.М., Букина Т.М., Захаров С.Ф., Михайлова С.Ф., Федонюк И.Д., Байдакова Г.В., Семикина Л.И., Колпакчи Л.М., Зайцева М.Н. „Резултати от селективен скрининг за наследствени метаболитни заболявания сред пациенти от невропсихиатрични отделения.“ Втори общоруски конгрес " Съвременни технологиипо педиатрия и детска хирургия,” Доклади на конгреса, стр. 141-142.
17. Байдакова Г.В., Букина А.М., Букина Т.М., Шехтер О.В., Михайлова С.В. I’lina E.S, Zakharova E.Yu Комбинация от тандемна масспектрометрия и анализ на лизозомни ензими - ефективен инструмент за селективен скрининг за IEM в неврологична клиника. 41-ви годишен симпозиум на SSIEM, Амстердам, 31 август – 3 септември 2004 г.
18. Михайлова С.В., Байдакова Г.В., Захарова Е.Й., Илина Е.С. Първи случаи на дефицит на биотинидаза в Русия. European Journal of Human Genetics Vol.13-Supplement1-May, 2005, p. 386.
19. Байдакова Г.В., Захарова Е.Ю., Зинченко Р.А. Дефицит на ацил-КоА дехидрогеназа на средноверижни мастни киселини. Доклади на V конгрес на Руското дружество по медицинска генетика, Уфа, май 2005 г., Медицинска генетика, том 4, № 4, стр. 153.
20. Захарова Е.Ю., Байдакова Г.В., Шехтер О.В., Илиина Е.С., Михайлова С.В. Тандемна масспектрометрия - нов подход за диагностициране на наследствени метаболитни нарушения, Доклади на V конгрес на Руското дружество по медицинска генетика, Уфа, май 2005 г., Медицинска генетика, том 4, № 4, стр. 188.
21. Михайлова С. В., Захарова Е. Ю., Байдакова Г. В., Шехтер О. В., Илина Е. С. Клинични резултати от глутарова ацидурия тип I в Русия. J.Inherit. Metab.Dis 2007, v. 30, стр. 38 22. Байдакова Г.В., Циганкова П.Г. Диагностика на митохондриални β-окислителни дефекти в Русия. J Inherit Metab Dis (2008) 31 (Допълнение 1) стр.39

Подготовка

Какво да направите, ако е необходимо да се изследва дете за наследствени метаболитни нарушения?

• По предписание на лекар или независимо във всеки медицински кабинет на INVITRO, трябва предварително да закупите тестов комплект, който включва:

Подготовка за изследване и правила за вземане на кръв от новородени

1. Вземането на кръвни проби от новородени се извършва в родилните домове от специално обучен служител, а при ранно изписване на новородено (преди 4 дни от живота) - от специално обучена патронажна сестра.
2. При изследване на новородени кръвна проба трябва да се вземе не по-рано от 4 дни при доносени и 7 дни при недоносени деца. При новородени кръвта се взема от петата, при деца над 3 месеца - от пръста.
3. При новородени от началото на пълното кърмене или изкуствено храненеПреди вземане на кръв трябва да минат поне 4 дни. Кръв се взема 3 часа след нахранване (при новородени - преди следващото хранене).
4. Преди да вземете кръв от новородено, кракът на детето трябва да се измие добре със сапун, да се избърше със стерилен тампон, навлажнен със 70% алкохол, и след това третираната зона да се попие със стерилна суха кърпа!
5. Пункцията се извършва със стерилен скарификатор за еднократна употреба на дълбочина 2,0 mm (пункционните зони са показани на). Първата капка кръв се отстранява със стерилен сух тампон.
6. Лекото натискане върху петата спомага за натрупването на втора капка кръв, върху която перпендикулярно се поставя специална карта от филтърна хартия и се напоява напълно и през 5 зони, очертани в кръгова линия. Петната от кръв не трябва да са по-малки от размера, посочен във формуляра, а външният вид на петната трябва да бъде еднакъв от двете страни. Никога не използвайте противоположната страна на филтърната хартия, за да запълните кръговете.
7. След като вземете кръв, подсушете мястото на убождането със стерилен тампон и поставете антибактериален пластир върху мястото на убождането. внимание! Точността и надеждността на изследването зависи от качеството на вземането на кръв!
8. Специална филтърна хартиена карта се суши най-малко 2 - 4 часа при стайна температура. Избягвайте пряка слънчева светлина! За да направите това, отстранете външния капак на картата и поставете ръба му под противоположната повърхност на филтъра (където няма кръгове). След като капките кръв изсъхнат напълно, преместете клапата на картата върху повърхността на филтъра. Подпишете фамилията на детето в долната част на картата (Име) и посочете датата на вземане на кръв (Дата). Поставете картичката в малък плик и я поставете в предварително подписан голям плик. Попълнете формата за поръчка и също я поставете в голям плик.
9. Предайте голям плик в най-близкия медицински кабинет на ИНВИТРО (пликът не е запечатан). Във Ваше присъствие служител на ИНВИТРО ще провери съдържанието на плика и коректността на попълване на формуляра за поръчка.

Съхранение и транспортиране: преди и след вземане на кръв, съхранявайте комплекта при стайна температура на сухо място; избягвайте контакт с отоплителните системи; избягвайте излагане на пряка слънчева светлина; При транспортиране опаковайте комплекта(ите) в херметически затворен найлонов плик.

Показания за употреба

• Подобни случаи на заболяването в семейството.
• Случаи на внезапна смърт на дете в ранна възраств семейството.
• Рязко влошаванесъстоянието на детето след кратък период на нормално развитие (асимптоматичният период може да варира от няколко часа до няколко седмици).
• Необичайна миризма на тяло и/или урина („сладко“, „мише“, „варено зеле“, „потни крака“ и др.).
• Неврологични разстройства- нарушения на съзнанието (летаргия, кома), Различни видовеконвулсивни атаки, промени в мускулния тонус (мускулна хипотония или спастична тетрапареза).
• Нарушения на дихателния ритъм (брадипнея, тахипнея, апнея).
• Нарушения на други органи и системи (чернодробно увреждане, хепатоспленомегалия, кардиомиопатия, ретинопатия).
• Промени в лабораторните показатели на кръвта и урината - неутропения, анемия, метаболитна ацидоза/алкалоза, хипогликемия/хипергликемия, повишена активност на чернодробните ензими и нивата на креатинфосфокиназата, кетонурия.
• Допълнителна диагностика 37 наследствени метаболитни заболявания, заедно със задължителната държавна програма за идентифициране на 5 наследствени заболявания: скрининг на новородени: „ПЕТА”.

Тълкуване на резултатите

Тълкуването на резултатите от изследването съдържа информация за лекуващия лекар и не е диагноза. Информацията в този раздел не трябва да се използва за самодиагностика или самолечение. Въз основа на резултатите лекарят поставя точна диагноза това проучване, така необходимата информацияот други източници: медицинска история, резултати от други изследвания и др.

Мерни единици в лаборатория INVITRO: µmol/литър. Референтни стойности за определяните параметри (подробна интерпретация на резултатите)

Обща интерпретация на резултата

Какво да направите, ако изследването разкрие промяна в показателите? Необходимо е да се разбере, че промените, идентифицирани по време на TMS, не потвърждават напълно заболяването и в някои случаи е необходимо да се подложат на допълнителни тестове (вижте списъка с допълнителни тестове и), за да се гарантира надеждността на идентифицираните нарушения. Препоръчва се консултация с генетик и педиатър за разработване на тактики за съвместни действия. Използвана литература (референтни стойности)

1. Wiley V., Carpenter K., Wilken B. Скрининг на новородени с тандемна масспектрометрия: 12 месеца опит в NSW Австралия. Acta Paediatrica 1999; 88 (Допълнение): 48-51.
2. Rashed MS, Rahbeeni Z, Ozand PT. Приложение на електроспрей тандемна масспектрометрия за неонатален скрининг. Semin Perinatol 1999; 23: 183-93.
3. Schulze A., Lindner M., Kohlmüller D., Olgemöller K., Mayatepek E., Hoffmann G.F. Разширен скрининг на новородени за вродени грешки на метаболизма чрез електроспрей йонизация-тандемна масспектрометрия: резултати, резултат и последици, Pediatrics, 2003; 111; 1399-1406.
4. Hoffman G., Litsheim T., Laessig R. Прилагане на тандемна масспектрометрия в програмата за скрининг на новородени в Уисконсин. MMWR Morb MortalWkly Rep 2001; 50 (RR-3): 26–7.
5. Lin W.D., Wu J.Y., Lai C.C., Tsai F.J., Tsai C.H., Lin S.P., Niu D.M. Пилотно проучване на неонатален скрининг чрез електроспрей йонизираща тандемна масспектрометрия в Тайван. Acta Paediatr Тайван 2001; 42:224-30.
6. Zytkovicz T.H., Fitzgerald E.F., Marsden D., Larson C.A., Shih V.E., Johnson D.M., et al. Тандемен масспектрометричен анализ за нарушения на амино, органични и мастни киселини в петна от изсъхнала кръв при новородени: двугодишно резюме от програмата за скрининг на новородени в Нова Англия. Clin Chem 2001; 47: 1945–55.

Общи принципи на лабораторна диагностика на наследствени метаболитни заболявания

На клинично ниво диагнозата NBO може само да бъде подозирана, а по-нататъшната диагноза зависи изцяло от използването на необичайни широк обхватбиохимични и молекулярно-генетични методи. В повечето случаи само комбинираната интерпретация на всички получени резултати дава възможност да се определи точно формата на заболяването.

Стратегията за надеждна диагностика на НБО включва няколко етапа: 1. Идентифициране на дефектно звено в метаболитния път чрез анализ (количествен, полуколичествен или качествен) на съответните метаболити; 2. Откриване на белтъчна дисфункция чрез оценка на количеството и/или активността му; 3. Изясняване характера на мутацията, т.е. характеристики на мутантния алел на генно ниво.

Тази стратегия се използва не само за решаване на научни проблеми, свързани с изследването на нормалния метаболизъм, молекулярните механизми на патогенезата на NBO и идентифицирането на генно-фенотипни корелации, тя е необходима преди всичко за практическата диагностика на NBO. Потвърждаването на диагнозата на ниво протеин и мутантен ген е необходимо както за пренатална диагностика, медицинско и генетично консултиране на обременени семейства, така и в някои случаи за предписване на адекватна терапия. Например, при дефицит на дихидроптеридин редуктаза, клиничният фенотип и нивата на фенилаланин ще бъдат неразличими от класическата форма на PKU, но подходите за лечение на тези заболявания са фундаментално различни. Значението на локусната диференциация на NBO за медицинско генетично консултиране може да се демонстрира чрез примера на мукополизахаридоза тип II (болест на Хънтър). Въз основа на спектъра на екскретираните гликозаминогликани е невъзможно да се разграничат мукополизахаридозите от тип II, I и VII, но от тези заболявания само болестта на Хънтър се унаследява по Х-свързан рецесивен тип, което е от фундаментално значение за прогнозата на потомство в засегнато семейство. Приоритетът на молекулярно-генетичните методи е безусловен при установяване на хетерозиготно носителство, както и при пренатална диагностика на заболявания, при които мутантният ензим не се експресира в клетките на хорионните въси.

Етап на изследване на метаболит

Оценката на метаболитите в биологичните течности е необходим етап в диагностиката на аминоацидопатия, органична ацидурия, мукополизахаридоза, митохондриални и пероксизомни заболявания, дефекти в метаболизма на пурин и пиримидин и др. Хроматографски методи за анализ играят жизненоважна роляпри диагностицирането на НБО. Това се дължи на факта, че съвременният арсенал от хроматографски технологии е изключително широк и дава възможност за ефективно и информативно разделяне на сложни многокомпонентни смеси, които включват и биологичен материал. За селективен скрининг на NBO успешно се използва тънкослойна хроматография, която позволява получаване на информация на качествено ниво. Този хроматографски метод е приложим за разделяне на аминокиселини, пурини и пиримидини, въглехидрати и олигозахариди. За количествен анализхроматографски методи като газова и високоефективна течна хроматография, както и газова хроматография-масспектрометрия (GC, HPLC и CMS, съответно) са успешно използвани за идентифициране на NBO метаболитни маркери. GC и HPLC са универсални методи за разделяне на сложни смеси от съединения и се характеризират с висока чувствителност и възпроизводимост. И в двата случая разделянето възниква в резултат на различни взаимодействия на компонентите на сместа със стационарната и подвижната фаза на хроматографската колона. За GC подвижната фаза е газ-носител, за HPLC е течност (елуент). Изходът на всяко съединение се записва от детектора на устройството, чийто сигнал се преобразува в пикове на хроматограмата. Всеки пик се характеризира с време на задържане и площ. Трябва да се отбележи, че GC обикновено се извършва при високи температури, така че ограничение за използването му е термичната нестабилност на съединенията. За HPLC няма такива ограничения, т.к в този случай анализът се извършва при меки условия. CMS е комбинирана GC или HPLC система с масово селективен детектор, което дава възможност да се получи не само количествена, но и качествена информация, т.е. Допълнително се определя структурата на съединенията в анализираната смес.

Едно от обещаващите направления в развитието на диагностичните програми на НБО е използването на методи, които позволяват количествено определяне на много метаболити, които са маркери различни групиНБО. Тези методи включват тандемна масспектрометрия (TMS). TMS ви позволява да характеризирате структурата, молекулното тегло и да определите количествено 3000 съединения едновременно. В този случай не се изисква продължителна подготовка на пробата за анализ (както например за GC), а времето за изследване отнема няколко секунди.

Етап на изследване на мутантен протеин

Изследването на мутантни протеини може да се извърши с помощта на различни методи:

1. Определяне на ензимната активност с използване на естествени субстрати;
2. Определяне на ензимната активност с помощта на изкуствени субстрати;
3. Зареждане на култивирани фибробласти с натрупани субстрати;
4. Измерване на протеиновата концентрация чрез имунохимични методи.

Материалът за измерване на ензимната активност при NBO са предимно левкоцити от периферната кръв: при почти всички лизозомни заболявания на съхранение, метилмалонова ацидурия и някои гликогенози. За диагностициране на GM2 ганглиозидоза и дефицит на биотинидаза се използва плазма или серум. В някои случаи обектите на изследване са мускулна или чернодробна тъкан: ензими на митохондриалната дихателна верига, гликогеноза. Културата на кожни фибробласти също се използва широко за диагностика.

Етап на изследване на мутантен ген

Развитието на методите на молекулярната биология беше истинска революция в областта на клиничната биохимия. Разработването на стандартни протоколи за молекулярни изследвания и автоматизирането на използваните методи днес са пълен набор от диагностични подходи и се превръщат в биохимични методирутинна процедура в клинични лаборатории. Бързото развитие на изследванията в областта на дешифрирането на човешкия геном и определянето на ДНК последователността на гените сега прави възможна ДНК диагностиката на различни наследствени заболявания. През последното десетилетие започнаха да се използват методи за ДНК диагностика и анализ на структурата на нормалните гени и техните мутантни аналози при наследствени метаболитни заболявания.

За ДНК диагностика на наследствени заболявания се използват два основни подхода - директна и индиректна ДНК диагностика. Директната ДНК диагностика е изследване на първичната структура на увреден ген и идентифициране на мутации, водещи до заболяването. За откриване на молекулярни увреждания в гени, които причиняват наследствени заболявания, се използва стандартен арсенал от методи на молекулярната биология. В зависимост от характеристиките и видовете мутации, тяхната честота на поява при различни наследствени заболявания, определени методи са най-предпочитани.

За диагностициране на NBO в случаите, когато биохимичният дефект е точно известен и лесно и надеждно определен с помощта на биохимични техники, ДНК методите едва ли ще имат приоритет. В тези случаи използването на ДНК анализ е по-скоро изследователски, отколкото диагностичен подход. Въпреки това, след точно установена диагноза, методите за ДНК анализ ще бъдат полезни за последваща пренатална диагностика, идентифициране на хетерозиготни носители в семейството и прогноза на заболяването при хомозиготи, както и за подбор на пациенти за целите на случайна терапия в бъдеще (ензимно заместване и генна терапия). Също така, в случаите, когато биохимичният дефект не е точно известен, биохимичната диагностика е трудна, не е достатъчно надеждна или изисква инвазивни методи на изследване, ДНК диагностичните методи са единствените и незаменими за точна диагноза.

IN общ изгледТактиката за диагностициране на NBO във всеки конкретен случай трябва да се планира съвместно с биохимик и генетик. Необходими условияуспешно и бърза диагностикае разбиране на етиологията, механизмите на патогенезата на заболяването, познаване на специфични биохимични маркери.