NS-3500 เป็นกล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนแบบคอนโฟคอลความเร็วสูง (CLSM) สำหรับการวัดภูมิประเทศพื้นผิว 3 มิติที่มีความแม่นยำสูงและเชื่อถือได้ การถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบเรียลไทม์ทำได้โดยการใช้โมดูลออปติคัลการสแกนที่รวดเร็วและอัลกอริธึมการประมวลผลข้อมูล

ระบบนี้เป็นโซลูชันที่น่าหวังสำหรับการวัดและตรวจสอบโครงสร้างด้วยกล้องจุลทรรศน์สามมิติ เช่น พื้นผิวเซมิคอนดักเตอร์ แผง FPD อุปกรณ์ MEMS พื้นผิวแก้ว และพื้นผิวต่างๆ กล้องจุลทรรศน์ NS-3500 ช่วยให้ตรวจวัดในพื้นที่ต่างๆ (พื้นที่สแกนสูงสุด 10 × 10 มม.) ของตัวอย่างที่มีขนาดสูงสุด 150 × 150 มม. เนื่องจากมีช่วงการเคลื่อนที่ที่กว้างของแท่น นอกจากนี้ยังมีความเป็นไปได้ในการขยายแพลตฟอร์มเป็น 200x200 มม.

หากจำเป็นต้องวัดจุด/พื้นที่ที่แตกต่างกันของตัวอย่างขนาดใหญ่ สามารถปรับเปลี่ยนหัวตรวจวัดประเภทอุตสาหกรรมได้ (ดู NS-3800)

• การตรวจสอบ 3 มิติด้วยแสงแบบไม่ทำลายด้วย ความละเอียดสูง
• การถ่ายภาพคอนโฟคอลแบบเรียลไทม์
• กำลังขยายแสงที่แตกต่างกันสำหรับพื้นที่ที่สังเกตได้
• กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลและแสงสีขาวพร้อมกัน
• ค้นหาค่าเกนอัตโนมัติเพื่อการโฟกัสแบบละเอียด
• การชดเชยความเอียง
• ง่ายต่อการวิเคราะห์ข้อมูลที่ได้รับ
• การวัดความสูงที่มีความแม่นยำสูงและความเร็วสูง
• โอกาส การวิเคราะห์เชิงคุณภาพความหนาของวัสดุโปร่งแสง
• ขาดการเตรียมตัวอย่าง
• โหมดการสแกนคู่ตามแกน Z แนวตั้ง
• การต่อภาพเพื่อวิเคราะห์พื้นที่ขนาดใหญ่

พื้นที่ใช้งาน

กล้องจุลทรรศน์สแกนด้วยเลเซอร์ NS-3500 เป็นระบบที่สมบูรณ์แบบสำหรับการวัดความสูง ความกว้าง ความลึก มุม พื้นที่ และการถ่ายภาพปริมาตรของโครงสร้างจุลภาค เช่น:

• เซมิคอนดักเตอร์ - พื้นผิว IC, ส่วนยื่นออกมา/ขั้นและความสูงของห่วงลวด, การวิเคราะห์ข้อบกพร่อง, กระบวนการ CPM (การวางแผนเชิงกลเคมี)
• จอแบน (FPD) - การวิเคราะห์แผงสัมผัส, วัสดุพิมพ์ ITO, ความสูงของคอลัมน์การแยกในจอแสดงผล LCD
• อุปกรณ์ MEMS - โปรไฟล์โครงสร้างสามมิติ ความขรุขระของพื้นผิว วัสดุพิมพ์
• พื้นผิวกระจก - เซลล์แสงอาทิตย์แบบฟิล์มบาง พื้นผิวเซลล์แสงอาทิตย์ การวิเคราะห์รูปแบบภายหลังการสัมผัสกับแสงเลเซอร์
• การวิจัยวัสดุ - การวิเคราะห์พื้นผิวตลับลูกปืนของอุปกรณ์จับยึด ความหยาบ และการบิ่น

ซอฟต์แวร์ NSWorks และ NSViewer

• การดำเนินการที่ง่ายและใช้งานง่ายแม้สำหรับผู้ใช้ใหม่
• ภาพ CCD, ภาพคอนโฟคอล และแผงควบคุมหลักจะแสดงพร้อมกันบนหน้าจอเดียว
• ตัวเลือกการปรับแต่งต่างๆ ที่ออกแบบมาสำหรับการใช้งานขั้นสูง
• การถ่ายภาพคอนโฟคอลแบบเรียลไทม์ให้การตอบสนองต่ออุปกรณ์ทันที
• แยกหน้าต่างการวิเคราะห์ด้วยเครื่องมือกราฟิกที่สะดวกสำหรับการรายงาน
• มุมมองกราฟิก 3 มิติช่วยให้ผู้ใช้จดจำโครงสร้างระดับจุลภาคของตัวอย่างได้อย่างง่ายดาย

การต่อภาพ

หากจำเป็นต้องวิเคราะห์พื้นที่การสแกนขนาดใหญ่ (สูงสุด 15×15 มม.) การวัดพื้นที่ขนาดเล็กแบบจุดต่อจุดตามลำดับจะพร้อมใช้งานพร้อมกับการเย็บต่อในภายหลัง คุณสมบัตินี้ดำเนินการผ่านการใช้เวทีแบบมอเตอร์และยูทิลิตี้ซอฟต์แวร์ NSMosaic เมื่อต่อภาพแล้ว จะสามารถวิเคราะห์ภาพที่ได้โดยรวมด้วยฟังก์ชันทั้งหมดที่มีอยู่จาก NSViewer

การตรวจสอบวิดีโอ: การเย็บภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนคอนโฟคอล NS-3500

ตัวอย่างการวัดโดยใช้ NS-3500

การวัดส่วนสูง VLSI	การวิเคราะห์การยื่นออกมาบน OLED	การวิเคราะห์ผลลัพธ์ การประมวลผลด้วยเลเซอร์ OLED
พื้นผิวควอตซ์	ผิวเพชร	ข้อบกพร่องบนกระจกโลหะ
ความไม่สม่ำเสมอบนพื้นผิวนูน	กราฟีน	พื้นผิวอินเดียมดีบุกออกไซด์
การวิเคราะห์โครงสร้างไมโครเลนส์	การวิเคราะห์พื้นที่แคบของสารตั้งต้น	ประเภทของตัวอย่างทดสอบ ที่กำลังขยายแสงที่แตกต่างกัน
การประมวลผลภาพโปรไฟล์แบบตัดขวาง	การต่อภาพเมื่อวิเคราะห์เหรียญ	การวิเคราะห์ลักษณะพื้นผิวของหยดน้ำ

กล้องจุลทรรศน์หลายพารามิเตอร์ที่ออกแบบใหม่จาก Leitz ช่วยให้สามารถวิเคราะห์การดูดซึมฮีโมโกลบินของเซลล์เม็ดเลือดแดงและการเรืองแสงของเซลล์ที่ติดฉลาก FITC ซึ่งมีฮีโมโกลบิน S ได้พร้อมกัน และสามารถวิเคราะห์เซลล์นับล้านได้ ระบบ (LEYTAS) ร่วมกับคอมพิวเตอร์วิเคราะห์ภาพ ขั้นแรกจะโฟกัสและนับเซลล์เม็ดเลือดแดงทั้งหมดในมุมมองแถวเดียวโดยใช้แสงสีม่วงที่มีแสงน้อย (415 นาโนเมตร) หลังจากการสแกนตามเส้นขนาด 8 ซม. เส้นเดียว การส่องสว่างจะเปลี่ยนจากส่งไปยังเหตุการณ์โดยคำสั่งคอมพิวเตอร์ และขอบเขตการมองเห็นทั้งหมดตามแนวเส้นสแกนจะได้รับการวิเคราะห์ใหม่ โดยสแกนหาวัตถุเรืองแสงตามเส้นโค้งของตำแหน่งโฟกัสที่กำหนดไว้ก่อนหน้านี้ สำหรับวัตถุเฉพาะแต่ละชิ้น ภาพฟลูออเรสเซนต์และการดูดกลืนแสงจะถูกจัดเก็บไว้ในหน่วยความจำเป็นระดับสีเทา จากหน่วยความจำภาพจะปรากฏบนหน้าจอโทรทัศน์ซึ่งช่วยให้คุณสามารถประเมินวัตถุที่เลือกด้วยสายตา (รูปที่ 6.9) สำหรับสัญญาณที่น่าสงสัยแต่ละภาพ ภาพฟลูออเรสเซนต์หนึ่งภาพและการดูดกลืนแสงสองภาพจะถูกเก็บไว้ในหน่วยความจำ การเปรียบเทียบภาพของแสงฟลูออเรสเซนต์และการดูดกลืนแสงที่กำลังขยายสูงทำให้สามารถระบุลักษณะของสัญญาณที่กำหนดได้ ด้วยวิธีนี้ สิ่งประดิษฐ์สามารถแยกแยะได้จากเซลล์ที่น่าสังเกต ความจริงที่ว่าสัญญาณนั้นสอดคล้องกับเซลล์กลายพันธุ์จริง ๆ ได้รับการยืนยันโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ เนื่องจากพิกัดทั้งหมดถูกจัดเก็บไว้ในหน่วยความจำ เซลล์จึงถูกวางโดยอัตโนมัติ สัญญาณส่วนใหญ่เป็นสิ่งประดิษฐ์ ในรูป ในเวอร์ชัน 6.9 เฉพาะเฟรมหมายเลข 79 เท่านั้นที่อาจหมายถึงเซลล์กลายพันธุ์ ซึ่งสามารถยืนยันได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์

ข้าว. 6.9. การตรวจจับภาพที่น่าสงสัยในสไลด์ที่เปื้อนด้วยเซรั่มต่อต้านฮีโมโกลบินที่มีป้ายกำกับ FITC โดยใช้ระบบ LEYTAS ภาพเหล่านี้จะแสดงบนจอภาพ จากซ้ายไปขวา: หมายเลขเฟรม ภาพเรืองแสง และภาพของเฟรมเดียวกันเกิดขึ้นเนื่องจากการดูดกลืนแสงที่กำลังขยายสูงกว่า

Langlois และคณะใช้แอนติบอดีชนิดอื่นที่ต่อต้านเม็ดเลือดแดงกลายพันธุ์ ซึ่งระบุเซลล์กลายพันธุ์โดยใช้โฟลว์ไซโตเมทรี สามารถสันนิษฐานได้ว่าความถี่ของการกลายพันธุ์ที่ระบุในงานนี้สูงกว่าความถี่ของการเกิดเซลล์ที่มี HbS อย่างมีนัยสำคัญ

นอกเหนือจากการระบุพันธุ์กลายพันธุ์หายากแล้ว การวิเคราะห์รูปภาพยังสามารถนำไปใช้ในการระบุพันธุ์พันธุ์หายากได้อีกด้วย เซลล์มะเร็งในระหว่างการบรรเทาอาการตลอดจนเซลล์ที่ติดเชื้อไวรัสด้วย ระยะเริ่มต้นโรคติดเชื้อ

7. กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกน

โดยทั่วไปในกล้องจุลทรรศน์ ภาพที่มีโครงสร้างขนาดเล็กมากจะได้มาจากการส่องสว่างทั้งสไลด์และขยายภาพด้วยเลนส์ใกล้วัตถุ เมื่อใช้กล้องโทรทัศน์ร่วมกับกล้องจุลทรรศน์ หลักการในการรับภาพจะไม่เปลี่ยนแปลง - ภาพจะถูกสร้างขึ้นโดยวัตถุด้วย จากนั้นจึงถูกสแกนโดยกล้องโทรทัศน์เท่านั้น ในความเป็นจริง วิธีการสแกนทั้งหมดถูกนำมาใช้เป็นหลักในด้านไมโครโฟโตมิเตอร์ที่จำกัดมาก เพื่อกำหนดค่าของการดูดกลืนแสง การเรืองแสง หรือการสะท้อนกลับ เมื่อเร็วๆ นี้ เทคนิคการสแกนได้ถูกนำมาใช้เพื่อสร้างภาพคุณภาพสูงโดยใช้ลำแสงเลเซอร์กำลังสูงและมีการจัดเรียงตัวอย่างดี ในกล้องจุลทรรศน์สแกนด้วยแสงเลเซอร์ วัตถุทั้งหมดจะไม่ได้รับแสงสว่าง แต่จะถูกสแกนทีละขั้นตอน ที่จุดส่องสว่างแต่ละจุด จะมีการวัดแสงที่ส่องผ่าน การสะท้อน หรือที่ปล่อยออกมา ภาพถูกสร้างขึ้นโดยการสะสมผลลัพธ์ของการวัดเหล่านี้สำหรับแต่ละจุดหลังจากที่ได้รับการประมวลผลแบบอะนาล็อกหรือดิจิทัล เช่น เมทริกซ์ในหน่วยความจำคอมพิวเตอร์

ในอุปกรณ์ที่มีอยู่ในห้องปฏิบัติการของเรา (Zeiss ประเทศเยอรมนี) การสแกนจะดำเนินการโดยใช้กัลวาโนมิเตอร์พร้อมเซอร์โวไดรฟ์ เวลาในการสแกนค่อนข้างสั้น (2 วินาทีต่อฟิลด์ขนาด 512x512 พิกเซล) กระบวนการสแกนถูกควบคุมโดยไมโครโปรเซสเซอร์ PMT ถูกใช้เป็นเครื่องตรวจจับแสง สัญญาณจะผ่านหน่วยประมวลผลแบบอะนาล็อก ซึ่งควบคุมความสว่างและคอนทราสต์

หลังจากการแปลงเป็นดิจิทัล สัญญาณนี้จะเข้าสู่หน่วยความจำบัฟเฟอร์ ซึ่งจะถูกบันทึกที่ความถี่วิดีโอ ดังนั้น จะได้ภาพที่นิ่งบนจอภาพโดยที่โต๊ะต้องอยู่กับที่ระหว่างการอ่าน กำลังขยายที่แตกต่างกันอย่างราบรื่นสามารถทำได้โดยใช้หน่วยกำลังขยายแบบแปรผัน กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์แบบสแกนสามารถใช้กับแหล่งกำเนิดแสงแบบธรรมดาหรือแบบเลเซอร์ก็ได้ เลเซอร์สามารถสร้างทั้งแสงตกกระทบ (สำหรับการสะท้อนและแสงฟลูออเรสเซนต์) และการส่องสว่างที่ส่องผ่าน (สำหรับการดูดซับ เฟส หรือคอนทราสต์การรบกวนที่แตกต่างกัน) เนื่องจากแหล่งกำเนิดแสงทั่วไป จึงสามารถใช้ได้เฉพาะหลอดไส้ที่มีตัวนำแสงเท่านั้น เพื่อให้มีโฟกัสและความสามารถในการค้นหาบนสไลด์ได้ดีขึ้น รวมถึงตรวจสอบสไลด์ที่มีคราบสองชั้น เราได้เพิ่มหน่วยการส่องสว่างแบบ epi-illumination แบบธรรมดาให้กับเครื่องสแกนเลเซอร์ ข้อดีหลักของการสแกนด้วยเลเซอร์คือ:

1) ระดับต่ำการเรืองแสงอัตโนมัติในเส้นทางแสงซึ่งทำได้โดยการส่องสว่างแบบจุด

2) ความไวแสงสูงของกล้องจุลทรรศน์อันเป็นผลมาจากการใช้แสงเลเซอร์อันทรงพลังที่โฟกัสไปที่จุดใดจุดหนึ่ง เป็นไปได้ที่จะสังเกตได้แม้กระทั่งแสงฟลูออเรสเซนต์อ่อนๆโพรบดีเอ็นเอ

3) การใช้เลนส์กำลังขยายต่ำ ความเข้มของแสงฟลูออเรสเซนต์สูงพอที่จะใช้กับเลนส์ X2.5 ได้ นี่เป็นข้อได้เปรียบที่สำคัญเมื่อทำการวิจัยสมอง

4) ระดับการซีดจางต่ำ เนื่องจากเวลาการส่องสว่างของแต่ละจุดสั้นมาก

5) ความสามารถในการวิเคราะห์หลายตัวแปร

6) สแกนตามลำดับไปที่ ระดับที่แตกต่างกันด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสแกน วิธีนี้ใช้ในการศึกษาที่จำเป็นต้องทำงานกับสารเรืองแสงที่อ่อนมาก

ตัวอย่างเช่น เมื่อทำปฏิกิริยาไฮบริไดเซชัน กล้องจุลทรรศน์สแกนด้วยเลเซอร์ยังเป็นประโยชน์ต่อการวิจัยสมองด้วย เนื่องจากช่วยให้สามารถใช้เลนส์ที่มีกำลังขยายต่ำ ซึ่งจำเป็นสำหรับการศึกษาการเชื่อมต่อในโครงข่ายประสาทเทียม ในรูป 6.10 นำเสนอ เซลล์ประสาทจากหนูฮิปโปแคมปัส เซลล์เหล่านี้ถูกติดป้ายกำกับเพื่อระบุโมเลกุลเฉพาะ เมื่อเปรียบเทียบกับกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบปกติ ความแตกต่างระหว่างภาพและพื้นหลังที่ได้จากการสแกนด้วยเลเซอร์จะสูงกว่ามาก โดยเหลือเพียงแสงพื้นหลังที่ไม่ต้องการในระดับต่ำมากเท่านั้น ด้วยการสแกนด้วยเลเซอร์ ปฏิกิริยายังสามารถวัดปริมาณได้ เนื่องจากเทคนิคนี้ช่วยให้สามารถตั้งค่าเกณฑ์ระหว่างเซลล์และพื้นหลังได้ เพื่อปรับปรุงคอนทราสต์ของภาพจากการเตรียมผลิตภัณฑ์ที่มีระดับของผลิตภัณฑ์ที่เกิดปฏิกิริยาต่ำมาก

นอกจากนี้ การสแกนด้วยเลเซอร์ยังเปิดโอกาสใหม่ๆ ในการตรวจสอบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงโดยไม่ต้องย้อมสีส่วนที่บางเฉียบเพิ่มเติมที่เตรียมไว้สำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน

ข้าว. 6.10. ภาพเรืองแสงของหนูฮิบโปที่ได้จากการใช้กล้องจุลทรรศน์สแกนด้วยเลเซอร์ ส่วนต่างๆ ได้รับการบำบัดด้วยแอนติบอดีต่อต้านกัวนีน โมโนฟอสเฟต ที่ติดฉลากเรืองแสง กำลังขยาย: เลนส์ X40; เลนส์ใกล้ตา XY สเกลบาร์ 100 µm.

8. วรรณกรรม

1. ยง ม.ร. (1961) Quart. เจ. ไมโครสค์. วิทย์, 102, 419.

2. ราคา, Z. H. (1965) น. เจ.เมด. เทคโนโลยี, 31, 45.

3. Rost, F. W. (1972) ในฮิสโตเคมี, ทฤษฎีและประยุกต์. Everson Pearse, A. G (ed.), Churchill Livingstone, Edinburgh, ฉบับที่ 2, น. 1171,

4. ซีเกล, เจ. ไอ. (1982) นานาชาติ ห้องทดลอง, 12, 46.

5. Ploem, J. S. และ Tanke, H. (1987) กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงเบื้องต้น Royal Microscopic Society, สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัย, ออกซ์ฟอร์ด

6. Lansing Taylor, D. , Waggoner, A. S. , Murphy, R. F. , Lanni, F. และ Birge, R. R. (1986) การประยุกต์ใช้การเรืองแสงในวิทยาศาสตร์ชีวการแพทย์ อลัน ลิสส์, นิวยอร์ก

7 Patzett, W. (1972) ลีทซ์-มิตต์. วิส. และเทคนิค Bd V, Nr 7, 226

8 Giloh, H. และ Sedat, J. W. (1982) วิทยาศาสตร์, 217, 1252.

9 Johnson, G. D. และ de C. Nogueira Araujo, G. M. (1981) J. Immunol. วิธีการ, 43, 349.

10 เพลิน, เจ. เอส. (1967) Zeitschrift Wiss. ไมโครสโคปี, 68, 129.

11 Nairn R. S (1976) การติดตามโปรตีนเรืองแสง ลิฟวิงสโตน, เอดินบะระ

12. Kraft, W. (1973) ไลทซ์เทค. แจ้ง.2,97.

Anthony van Leeuwenhoek มักถูกเรียกว่าเป็นผู้ประดิษฐ์กล้องจุลทรรศน์ จากมุมมองทางประวัติศาสตร์ สิ่งนี้ไม่เป็นความจริงเลย: กาลิเลโอผู้โด่งดัง แจนเซน พ่อและลูกชาย และคอร์นีเลียส เดรบเบล นำเสนอผลงานของพวกเขามานานต่อหน้าเขา เครื่องมือทางแสง. อย่างไรก็ตามชื่อเสียงของ Leeuwenhoek นั้นไม่ได้ไร้เหตุผลเลย: เขาเป็นคนแรกที่สามารถตรวจสอบได้ สิ่งมีชีวิตเซลล์เดียวเซลล์เม็ดเลือดโครงสร้างของดวงตาของแมลง - นั่นคือไปถึงระดับจุลภาคจริงๆ

การตกหล่นและไม่ล้มเป็นงานที่ยากที่สุด ตัวเรือนดินสอหรือปากกาลูกลื่นเหมาะสำหรับสิ่งนี้ มันคุ้มค่าที่จะทดลองกับมุมเอียงและปริมาณน้ำ

ตรงกันข้ามกับความเชื่อที่นิยม กล้องจุลทรรศน์ของลีเวนฮุกไม่เหมือนกับกล้องจุลทรรศน์สมัยใหม่เลย ประกอบด้วยเลนส์เดี่ยวที่ยึดอยู่ในขาตั้งกล้องแบบพิเศษ คนโง่เขลาจะเรียกอุปกรณ์นี้ว่าแว่นขยาย

การกดปุ่มหยดน้ำด้วยเลเซอร์ไม่ใช่เรื่องง่าย ความสามารถในการติดพอยน์เตอร์ได้อย่างปลอดภัยถือเป็นสิ่งสำคัญมาก เราใช้ขาบัดกรีจากร้านวิทยุ

หยดน้ำก็คือเลนส์ตัวเดียวกัน ดูคำจำกัดความ: เลนส์คือชิ้นส่วนของวัสดุเนื้อเดียวกันโปร่งใสที่ล้อมรอบด้วยพื้นผิวการหมุนหักเหของแสงสองอันขัดเงา (พื้นผิวทรงกลม) หยดนี้มีรูปร่างเป็นทรงกลม น้ำเป็นเนื้อเดียวกัน แรงตึงผิวทำงานได้ดีกว่ายาขัดใดๆ ที่หยดลงไป และสุดท้าย ดัชนีการหักเหของน้ำก็ไม่เท่ากับอากาศ ซึ่งหมายความว่าการหยดถือเป็นเลนส์แม้ว่าจะไม่ใช่เลนส์ที่ดีมากก็ตาม

พื้นที่ของภาพบนหน้าจอมีขนาดใหญ่กว่าหน้าตัดของลำแสงเลเซอร์หลายเท่า ดังนั้นเพื่อให้แน่ใจว่าภาพที่สดใสจึงคุ้มค่าที่จะรับตัวชี้เลเซอร์อันทรงพลังพร้อมลำแสงสีเขียว

หากเราชี้ตัวชี้เลเซอร์ไปที่หยดและฉายลงบนกระดาษสีขาว เราจะเห็นว่าเกิดอะไรขึ้นภายในหยดนั้น เลเซอร์สร้างรังสีที่สอดคล้องกัน (ในเชิงเปรียบเทียบ ขนานกัน) ดังนั้นเราจึงสามารถพูดได้ว่าลำแสงของมันถูกโฟกัสอย่างสมบูรณ์แบบตั้งแต่แรก ตามทฤษฎีแล้ว สามารถใช้หลอดไฟธรรมดาได้ แต่หากต้องการโฟกัสแสงไปที่หยดอย่างแม่นยำ จำเป็นต้องมีระบบออพติคอลที่ซับซ้อนกว่านี้มาก อย่าหลอกตัวเอง: นี่เป็นประสบการณ์ที่ดีในด้านทัศนศาสตร์ แต่ไม่ใช่ในด้านชีววิทยา ปัจจัยการขยายของหยดมีขนาดเล็ก ดังนั้นวัตถุที่คุณเห็นบนหน้าจอจึงไม่ใช่จุลินทรีย์เลย แต่เป็นเพียงอนุภาคฝุ่นหรือเส้นขนเล็กๆ เอฟเฟกต์การเคลื่อนไหวถูกสร้างขึ้นโดยการผสมน้ำภายในหยด แต่ถึงกระนั้นประสบการณ์ก็ไม่สามารถปฏิเสธได้ในแง่ของความบันเทิง

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเป็นหนึ่งในวิธีการใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงซึ่งมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกล้องจุลทรรศน์แบบคลาสสิกทั่วไป คุณสมบัติที่โดดเด่น วิธีนี้คือการใช้ไดอะแฟรมที่สามารถตัดการไหลของแสงที่กระจัดกระจายในพื้นหลังได้

ในกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล ภาพกระแสหนึ่งของวัตถุจะถูกบันทึกในแต่ละช่วงเวลา จะได้ภาพที่สมบูรณ์โดยการสแกนการเคลื่อนไหวของตัวอย่างหรือจัดเรียงระบบออพติคอลใหม่ หลังจากเลนส์ใกล้วัตถุ ไดอะแฟรมขนาดเล็กจะอยู่ในตำแหน่งเพื่อให้แสงที่ปล่อยออกมาจากจุดที่กำลังศึกษาผ่านเข้าไปและถูกบันทึกไว้ และแสงที่เล็ดลอดออกมาจากจุดอื่นๆ จะถูกหน่วงโดยไดอะแฟรม

วิธีการวิจัยที่อธิบายไว้ช่วยให้เราสามารถศึกษาโครงสร้างภายในได้ เซลล์ต่างๆ. ด้วยความช่วยเหลือนี้ คุณสามารถระบุแต่ละโมเลกุลและโครงสร้างเซลล์ จุลินทรีย์ รวมถึงกระบวนการไดนามิกที่เกิดขึ้นในเซลล์ได้

คำอธิบายวิธีการใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล

ด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลฟลูออเรสเซนซ์ ทำให้สามารถขยายวัตถุในระดับซับไมครอนสามมิติได้ และความสามารถในการวิเคราะห์ตัวอย่างโปร่งใสโดยไม่ทำลายก็ขยายออกไปอย่างมีนัยสำคัญเช่นกัน ด้วยการใช้เลเซอร์เป็นแหล่งกำเนิดแสงในกล้องจุลทรรศน์เหล่านี้ ทำให้ความละเอียดของพวกมันเพิ่มขึ้น

เมื่อเปรียบเทียบกับหลอดไฟซีนอนหรือหลอดปรอท เลเซอร์มีข้อได้เปรียบที่สำคัญ เนื่องจากมีความสามารถในการเป็นสีเดียว และขนานกับลำแสงที่ปล่อยออกมาอย่างมาก คุณสมบัติดังกล่าว รังสีเลเซอร์ช่วยให้ระบบออพติคอลทำงานได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น ทั้งยังลดปริมาณแสงสะท้อนและเพิ่มความแม่นยำในการโฟกัสลำแสงอีกด้วย

ในตัวอย่างที่กำลังศึกษา เลเซอร์ไม่ได้ส่องสว่างทั่วทั้งขอบเขตการมองเห็น แต่โฟกัสไปที่จุดใดจุดหนึ่ง ไดอะแฟรมคอนโฟคอลช่วยให้คุณกำจัดแสงฟลูออเรสเซนต์ที่อยู่นอกโฟกัสได้ ในขณะที่เปลี่ยนเส้นผ่านศูนย์กลางของไดอะแฟรม คุณสามารถกำหนดความหนาของชั้นออปติคอลใกล้กับโฟกัสของลำแสงเลเซอร์ได้อย่างแม่นยำ ด้วยคุณสมบัตินี้ กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลจึงช่วยให้มีความละเอียดที่ดีขึ้นตามแกน Z

โปรแกรมพิเศษที่ติดตั้งกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลช่วยให้คุณสร้างได้ ภาพเชิงปริมาตรวัตถุและมองจากมุมที่ต่างกัน

การใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสแกนด้วยเลเซอร์หลายสเปกตรัมทำให้สามารถศึกษาการรวมตัวกันในเซลล์ได้ สารต่างๆ. โหมดหลายสเปกตรัมช่วยให้คุณทำการศึกษาปลาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล

ตัวอย่างการศึกษาที่ดำเนินการโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลช่วยศึกษาความสามารถของสารต่างๆ ในการสะสมในนิวเคลียส ไซโตพลาสซึม หรือโครงสร้างเซลล์อื่นๆ ความสามารถเหล่านี้มักใช้ในกระบวนการวิจัยกลไกการออกฤทธิ์ของสารก่อมะเร็ง สารประกอบต้านมะเร็ง ยาและยังให้ผู้หนึ่งคำนวณความเข้มข้นที่มีประสิทธิผลได้ด้วย

การศึกษาความเข้มถึงตายตลอดจนรูปร่างของสเปกตรัมของการเรืองแสงภายในทำให้สามารถจดจำเซลล์ที่อักเสบและเซลล์ปกติได้ วิธีการนี้ใช้กับ ระยะแรกการวินิจฉัยมะเร็งปากมดลูก

การผสมผสานตัวกรองต่างๆ ที่เลือกอย่างเหมาะสมซึ่งออกแบบมาสำหรับสารเรืองแสงภายในหลายประเภทสามารถหาได้ โดยไม่ต้องมีการตรวจสอบส่วนต่างๆ ที่ต้องใช้แรงงานคนมาก ด้วยวิธีนี้ จึงสามารถตรวจพบและแยกแยะโครงสร้างเนื้อเยื่อเนื้อร้ายจากโครงสร้างปกติได้อย่างรวดเร็วและแม่นยำ

วิธีการใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลใช้กันอย่างแพร่หลายในด้านอุทกชีววิทยาและคัพภวิทยา พฤกษศาสตร์และสัตววิทยาในกระบวนการศึกษาโครงสร้างของเซลล์สืบพันธุ์ ตลอดจนการพัฒนาและการก่อตัวของสิ่งมีชีวิต

กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์คอนโฟคอลใน โลกสมัยใหม่พบ ประยุกต์กว้างในสาขาชีววิทยา ชีวฟิสิกส์ การแพทย์ เซลล์และอณูชีววิทยา กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเป็นเทคนิคแบบไม่สัมผัสเฉพาะที่ใช้ในปัจจุบันเพื่อศึกษากระจกตา ช่วยให้คุณสามารถประเมินระดับการเปลี่ยนแปลงของเซลล์และโครงสร้างภายนอกเซลล์ที่มีอยู่ได้อย่างแม่นยำที่สุดรวมทั้งสรุปข้อสรุปเกี่ยวกับความเสียหายที่อาจเกิดขึ้นกับกระจกตาโดยรวม

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบเลเซอร์มีความละเอียดสูง จึงสามารถศึกษาโครงสร้างของเซลล์ที่มีป้ายกำกับเรืองแสงและแม้แต่ยีนแต่ละตัวได้ การใช้เทคโนโลยีต่าง ๆ สำหรับการย้อมสีฟลูออเรสเซนต์หลากสีเฉพาะสำหรับโมเลกุลที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพรวมถึงคอมเพล็กซ์ซูปราโมเลคิวลาร์ทำให้สามารถศึกษาได้ กลไกที่ซับซ้อนการทำงานของไม่เพียงแต่ละเซลล์เท่านั้น แต่ยังรวมถึงทั้งระบบด้วย เทคโนโลยีนี้ใช้กันอย่างแพร่หลายในชีววิทยาเชิงทดลองและในทางการแพทย์

อุปกรณ์: กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลความแม่นยำสูงพิเศษสมัยใหม่ เช่น Leica TCS SP8 ช่วยให้คุณได้รับข้อมูลที่ชัดเจนและเชื่อถือได้มากที่สุดเมื่อทำการศึกษาต่างๆ ความสนใจอย่างกว้างขวางในอุปกรณ์ดังกล่าวเกิดขึ้นในช่วงแปดสิบของศตวรรษที่ผ่านมาเนื่องจากการพัฒนาอย่างรวดเร็วของเทคโนโลยีคอมพิวเตอร์และเทคโนโลยีเลเซอร์

กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนคอนโฟคอลเป็นกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงชนิดหนึ่ง ลักษณะเฉพาะของมันคือลำแสงเลเซอร์จะโฟกัสไปที่พื้นที่เฉพาะตามแนวแกน X และ Y และสร้างภาพขึ้นมา แสงสะท้อนจะแสดงบนหน้าจอในรูปแบบแรสเตอร์ ขนาดของภาพโดยตรงขึ้นอยู่กับความละเอียดของอุปกรณ์อิเล็กทรอนิกส์สมัยใหม่ตลอดจนขนาดของแรสเตอร์ที่สแกน

เครื่องมือวัดที่สร้างขึ้นโดยใช้ วิธีการที่ทันสมัยกล้องจุลทรรศน์สแกนด้วยเลเซอร์คอนโฟคอล แพร่หลายในปัจจุบัน พื้นที่ที่แตกต่างกัน. เมื่อเปรียบเทียบกับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไป กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลมีข้อดีดังต่อไปนี้:

• ความละเอียดที่ดีขึ้น
• คอนทราสต์ของภาพสูง
• ความสามารถในการทำการศึกษาแบบหลายสเปกตรัมด้วยการแยกสัญญาณในระดับสูง
• ความสามารถในการรับ "ส่วนแสง" ด้วยการสร้างใหม่สามมิติ
• ความเป็นไปได้ของการใช้วิธีการประมวลผลแบบดิจิทัลสำหรับภาพที่ได้รับ

ข้อเสียของอุปกรณ์ที่อธิบายไว้ ได้แก่ :

• ความซับซ้อนในการตั้งค่าอุปกรณ์
• ขาดภาพแสง
• อุปกรณ์ราคาสูงตลอดจนค่าบำรุงรักษาสูง

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลใช้คอมพิวเตอร์พิเศษในการควบคุมระบบทั้งหมด ช่วยให้คุณสามารถบันทึกภาพและศึกษาข้อมูลผลลัพธ์โดยละเอียด การประมวลผลภาพที่ได้คุณภาพสูงมักจะต้องใช้พลังในการประมวลผลค่อนข้างมาก ดังนั้นคอมพิวเตอร์จะต้องมี RAM ที่ค่อนข้างใหญ่ สำหรับการจัดเก็บข้อมูลเพิ่มเติม จำเป็นต้องมีหน่วยความจำดิสก์ขนาดใหญ่ด้วย ในการถ่ายโอนภาพ คอมพิวเตอร์จะต้องมีพอร์ต USB หรือ CD/DVDRW คอมพิวเตอร์ยังมีความสามารถในการเชื่อมต่ออีกด้วย อินเทอร์เน็ตทั่วโลกหรือเครือข่ายท้องถิ่น

ซอฟต์แวร์ที่ติดตั้งบนคอมพิวเตอร์ดังกล่าวอาจเป็นซอฟต์แวร์พื้นฐาน มาพร้อมกับอุปกรณ์และช่วยให้คุณสามารถจัดการระบบทั้งหมดและตรวจสอบฟังก์ชันพื้นฐานของระบบได้ นอกจากนี้ แพคเกจงานแอปพลิเคชันยังได้รับการพัฒนาเป็นพิเศษสำหรับคอมพิวเตอร์เหล่านี้ซึ่งสั่งซื้อเพิ่มเติมอีกด้วย กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลหลายรุ่นมีแผงควบคุมพิเศษที่ให้คุณกำหนดค่าการทำงานจากระยะไกลได้

ติดตั้งอุปกรณ์ที่อธิบายไว้ระหว่างการเข้ารับการตรวจในห้องปฏิบัติการตามปกติ ขั้นตอนที่สำคัญที่สุดระหว่างการทำงานของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลคือการควบคุมการสั่นสะเทือน เพื่อจุดประสงค์ดังกล่าวจะใช้อุปกรณ์พิเศษเพื่อวัดระดับการสั่นสะเทือน ขั้นตอนการควบคุมจะคล้ายกับขั้นตอนการวัดความละเอียดตามแนวแกนของ LSCM โดยใช้กระจกเงา

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลมีการพัฒนาอย่างรวดเร็ว บริษัทผู้ผลิตที่มีชื่อเสียงออกสู่ตลาด การออกแบบล่าสุดกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลที่ช่วยให้คุณสามารถแยกลำแสงกระตุ้นด้วยเลเซอร์และการเรืองแสงได้อย่างมีประสิทธิภาพ ตัวแยกลำแสงในอุปกรณ์ดังกล่าวควบคุมโดยคอมพิวเตอร์ หากจำเป็น คุณสมบัติสเปกตรัมสามารถปรับเป็นเส้นเลเซอร์หลายเส้นได้อย่างรวดเร็ว

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลในจุลชีววิทยา

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลยังขาดไม่ได้ในด้านชีววิทยาสำหรับ การวิจัยโดยละเอียดเซลล์. ปัจจุบันมีการเผยแพร่บทความทางวิทยาศาสตร์ต่างๆ จำนวนมากในหัวข้อนี้ ส่วนใหญ่มักใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเพื่อศึกษาโครงสร้างของเซลล์รวมถึงออร์แกเนลล์ของพวกมัน นอกจากนี้ยังมีการศึกษาการรวมตัวกันในเซลล์เพื่อทำความเข้าใจว่ามีความสัมพันธ์ระหว่างเหตุและผลระหว่างสารต่างๆ ในเซลล์หรือไม่

ในกระบวนการศึกษาโปรตีนด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล พวกมันจะถูกติดฉลากเบื้องต้นด้วยแอนติบอดีที่มีฟลูออโรโครมต่างกัน การใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคลาสสิกธรรมดา เป็นการยากที่จะแยกแยะว่าพวกมันอยู่ติดกันหรืออยู่ข้างกัน แต่กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลช่วยให้คุณทำสิ่งนี้ได้โดยไม่ต้อง ปัญหาพิเศษ. ข้อมูลในชุดของส่วนแสงจะถูกบันทึกลงในหน่วยความจำคอมพิวเตอร์ดังนั้นจึงมีการสร้างวัตถุขึ้นใหม่ตามปริมาตรและได้รับภาพสามมิติด้วย

นอกจากนี้ ด้วยความช่วยเหลือของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล การศึกษากระบวนการไดนามิกที่เกิดขึ้นในเซลล์ที่มีชีวิต เช่น การเคลื่อนที่ของแคลเซียมไอออนหรือสารอื่น ๆ ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลยังใช้เพื่อศึกษาการเคลื่อนที่ของโมเลกุลชีวอินทรีย์โดยใช้การแตกตัวเป็นไอออนของการสลายตัวทางโฟโตเคมีคอลของฟลูออโรโครมในเขตการฉายรังสี รวมถึงการแยกตัวออกจากโมเลกุลในภายหลัง โมเลกุลดังกล่าวมีป้ายกำกับว่าฟลูออโรโครม 2 ชนิดซึ่งมีสเปกตรัมการแผ่รังสีของผู้บริจาค ซึ่งซ้อนทับกับสเปกตรัมการดูดกลืนแสงของตัวรับ ดังนั้นพลังงานจึงถูกถ่ายโอนจากผู้บริจาคไปยังผู้รับในระยะทางสั้นๆ และเป็นผลมาจากการสั่นพ้องระหว่างระดับพลังงาน หลังจากนั้น ตัวรับจะปล่อยพลังงานออกมาในบริเวณที่มองเห็นได้ของสเปกตรัม ซึ่งต่อมาจะถูกบันทึกโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล

การพัฒนากล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลยังคงดำเนินต่อไป ผู้ผลิตอุปกรณ์นี้นำเสนอกล้องจุลทรรศน์ที่ทันสมัย ​​ใช้งานได้และได้รับการปรับปรุงมากขึ้นเรื่อยๆ ในตลาดเป็นประจำทุกปี ช่วยให้นักวิทยาศาสตร์สามารถค้นพบสิ่งใหม่ๆ ที่มีประโยชน์ในหลากหลายสาขา ซอฟต์แวร์ที่ออกแบบมาสำหรับคอมพิวเตอร์ที่ติดตั้งกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลก็กำลังได้รับการปรับปรุงเช่นกัน ช่วยให้คุณสามารถดำเนินงานที่ซับซ้อนที่สุดซึ่งทำให้สามารถดำเนินการวิจัยในระดับโมเลกุลและเซลล์ได้ ปัจจุบันนี้เราสามารถพูดได้อย่างมั่นใจว่ากล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลคืออนาคต เนื่องจากในแง่ของคุณลักษณะการทำงานและความสามารถทางเทคนิคแล้ว กล้องจุลทรรศน์ชนิดนี้จึงเหนือกว่ากล้องจุลทรรศน์ทั่วไปอย่างมาก ในบรรดาอุปกรณ์คอนโฟคอลออพติคอลที่มีค่อนข้างหลากหลาย ผู้ใช้แต่ละคนจะสามารถเลือกกล้องจุลทรรศน์ที่เหมาะกับตัวเองได้ ซึ่งจะทำให้เขาสามารถพัฒนางานวิจัยของเขาได้อย่างแข็งขัน

กล้องจุลทรรศน์สองโฟตอนเป็นกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบมัลติโฟตอนชนิดหนึ่ง ข้อดีของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลคือมีความสามารถในการทะลุทะลวงมากกว่าและมีความเป็นพิษต่อแสงในระดับต่ำ

กล้องจุลทรรศน์สองโฟตอนถูกสร้างขึ้นครั้งแรกโดย Winfred Denck ในห้องปฏิบัติการของ W. W. Webb ที่ Cornell University เขารวมแนวคิดเรื่องการกระตุ้นสองโฟตอนเข้ากับการสแกนด้วยเลเซอร์

กระบวนการกระตุ้นด้วยโฟตอนสองโฟตอนเกิดขึ้นดังนี้: โฟตอนพลังงานต่ำสองตัวกระตุ้นฟลูออโรฟอร์ (โมเลกุลหรือส่วนหนึ่งของโมเลกุลที่สามารถเรืองแสงได้) ในระหว่างเหตุการณ์ควอนตัมครั้งหนึ่ง ผลลัพธ์ของการกระตุ้นนี้คือการปล่อยโฟตอนฟลูออเรสเซนต์จากโมเลกุลที่ถูกกระตุ้นในเวลาต่อมา พลังงานของโฟตอนฟลูออเรสเซนต์มีมากกว่าพลังงานของโฟตอนที่น่าตื่นเต้น

ความน่าจะเป็นที่โฟตอนที่กระตุ้นทั้งสองจะถูกดูดซับโดยโมเลกุลเดียวนั้นน้อยมาก ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีโฟตอนที่น่าตื่นเต้นจำนวนมาก ซึ่งสามารถรับได้โดยใช้โฟตอนเปล่งแสงเลเซอร์ที่มีอัตราการเกิดซ้ำของพัลส์สูง (80 MHz) ฟลูออโรฟอร์ที่ใช้กันมากที่สุดมีสเปกตรัมการกระตุ้นในช่วง 400-500 นาโนเมตร ในขณะที่ความยาวคลื่นเลเซอร์กระตุ้นอยู่ในช่วง 700-1000 นาโนเมตร (ความยาวคลื่นอินฟราเรด) หากฟลูออโรฟอร์ดูดซับโฟตอนสองตัวพร้อมกัน ก็จะได้รับพลังงานเพียงพอที่จะเข้าสู่สภาวะตื่นเต้น จากนั้นฟลูออโรฟอร์ที่ตื่นเต้นจะปล่อยโฟตอนออกมาหนึ่งโฟตอน (ในส่วนที่มองเห็นได้ของสเปกตรัม) ความยาวคลื่นจะขึ้นอยู่กับประเภทของฟลูออโรฟอร์

เนื่องจากการดูดซับโฟตอนสองตัวเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับฟลูออโรฟอร์ที่จะตื่นเต้น ความน่าจะเป็นที่ฟลูออโรฟอร์จะปล่อยโฟตอนทุติยภูมิจึงเป็นสัดส่วนกับกำลังสองของความเข้มของการกระตุ้น ดังนั้นการเรืองแสงจะแข็งแกร่งขึ้นเมื่อลำแสงเลเซอร์ถูกโฟกัสอย่างชัดเจนแทนที่จะกระจัดกระจาย การเรืองแสงสูงสุดจะสังเกตได้ในปริมาตรโฟกัส (ปริมาตรที่ลำแสงเลเซอร์ถูกโฟกัส) และแสดงให้เห็นการลดลงอย่างมากในบริเวณที่อยู่นอกโฟกัส

ออกแบบ

ในกล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอน ลำแสงเลเซอร์อินฟราเรดจะถูกโฟกัสโดยเลนส์ใกล้วัตถุที่รวบรวม โดยทั่วไปจะใช้เลเซอร์แซฟไฟร์ความถี่สูง 80 MHz โดยเปล่งแสงระยะเวลาพัลส์ที่ 100 เฟมโตวินาที ทำให้มีความหนาแน่นของโฟตอนฟลักซ์สูงที่จำเป็นสำหรับการดูดซับโฟตอนสองโฟตอน

แสงที่ปล่อยออกมาจากตัวอย่างฟลูออเรสเซนต์จะถูกขยายโดยหลอดโฟโตมัลติพลายเออร์ที่มีความไวสูง เนื่องจากเครื่องตรวจจับแสงเป็นแบบช่องเดียว ความเข้มของแสงที่สังเกตได้ในปริมาตรโฟกัสที่กำหนดจึงก่อตัวเป็นหนึ่งพิกเซลในภาพ เพื่อให้ได้ภาพพิกเซลสองมิติ การสแกนจะดำเนินการในระนาบโฟกัสของตัวอย่าง

ข้อดีและข้อเสีย

การใช้แสงอินฟราเรดเพื่อกระตุ้นฟลูออโรฟอร์ในเนื้อเยื่อที่กำลังศึกษามีข้อดีดังนี้

• คลื่นยาวกระจัดกระจายน้อยกว่าคลื่นสั้น ซึ่งให้ความละเอียดเชิงพื้นที่สูง
• โฟตอนที่น่าตื่นเต้นมีพลังงานต่ำ ดังนั้นจึงทำลายเนื้อเยื่อได้น้อยกว่า (ซึ่งจะช่วยยืดอายุของเนื้อเยื่อที่กำลังศึกษาอยู่)

แต่ก็มีข้อเสียอยู่บ้าง:

• การทำงานของเลเซอร์ต้องใช้เครื่องมือทางแสงที่มีราคาแพงเพื่อให้แน่ใจว่ามีความเข้มของพัลส์
• สเปกตรัมการดูดกลืนแสงแบบสองโฟตอนของฟลูออโรฟอร์อาจแตกต่างกันอย่างมาก ตรงกันข้ามกับสเปกตรัมการดูดกลืนแสงแบบโฟตอนเดี่ยว
• ลำแสงที่มีความยาวคลื่นมากกว่า 1,400 นาโนเมตรจะถูกน้ำในเนื้อเยื่อของสิ่งมีชีวิตดูดซับไว้อย่างมีนัยสำคัญ