Лаборатория наследственных болезней обмена веществ была создана в Медико-генетическом научном Центре более 30 лет назад. Первые работы в лаборатории были связаны с разработкой тестов для выявления фенилкетонурии и программ селективного скрининга наследственные болезни обмена веществ (НБО). Постепенно лаборатория перешла к применению сложных биохимических и молекулярно-генетических методов точной диагностики наследственных заболеваний. Именно здесь под руководством профессора Ксении Дмитриевны Краснопольской были разработаны подходы к биохимической диагностике болезней клеточных органелл. Сегодня это единственная в России лаборатория, где проводится постнатальная и пренатальная диагностика подавляющего большинства заболеваний из этой группы.

Одним из научных направлений работы подразделения является поиск новых биохимических маркеров для наследственных болезней, разработка новых методов их эффективной диагностики.

Спектр биохимических методов, используемых в лаборатории, исключительно широк и включает: электорофорез гликозаминогликанов мочи, изоэлектрофокусирование трансферинов, хромато-масс-спектрометрию, высокоэффективную жидкостную хроматографию, анализ активности лизосомных и митохондриальных ферментов с применением хромогенных и флуорогенных субстратов, окисграфии. Некоторые из форм НБО, ранее не выявляемые в нашей стране, в лаборатории были диагностированы впервые.

Существенным прорывом в диагностике НБО стало внедрение метода тандемной масс-спектрометрии, который позволяет в микроколичествах биологического материала (пятно высушенной крови или плазмы) выявлять около 30 форм наследственных заболеваний из групп самых распространенных НБО: аминоацидопатий, органическиих ацидурий и дефектов митохондриального β-окисления.

Последние годы в лаборатории активно развиваются имолекулярно-генетические методы. Для некоторых заболеваний из группы НБО созданы протоколы ДНК-диагностики, позволяющие сократить время установления диагноза и избежать применения трудоемких и инвазивных биохимических методов. С 2015 года в лаборатории применяют секвениование нового поколения для одновременного анализа множества генов. Такие панели разработаны для митохондриальных заболеваний, наследственных болезней с преимущественным поражением печени, лейкодистрофий/ лейкоэнцефалопатий.

На сегодняшний день используемые биохимические и молекулярно-генетические методы позволяют диагностировать более 200 различных форм наследственных болезней обмена веществ.

В лаборатории ведется работа по характеристике спектра и частоты мутаций при наследственных мукополисахаридозах, сфинголипидозах, нейрональных цероидных липофусцинозах, разрабатываются алгоритмы диагностики заболеваний, протекающих с поражением белого вещества головного мозга, а также других наследственных нейрометаболических нарушений.

Описание

Подготовка

Показания

Интерпретация результатов

Документы к заполнению

Описание

Метод определения

Тандемная масс-спектрометрия с ионизацией в электроспрее.

Исследуемый материал Капиллярная кровь, собранная на специальную карточку-фильтр №903

Анализ спектра аминокислот и ацилкарнитинов методом тандемной масс-спектрометрии (ТМС)

Что такое нарушения метаболизма? Наследственные нарушения метаболизма или по-другому обмена веществ - это около 500 различных заболеваний, которые обусловлены нарушением работы особых биохимических катализаторов - ферментов. Ферменты обеспечивают процессы расщепления аминокислот, органических кислот, жирных кислот и других биомолекул. Многие ошибочно считают, что поскольку заболевания этой группы встречаются крайне редко, то и исключать их нужно в последнюю очередь. Однако по данным литературы*, наследственными нарушениями метаболизма страдает один из 3000 новорождённых!

Особое место среди этих заболеваний занимают болезни, которые начинаются в раннем детском возрасте. Эти заболевания часто сочетаются с тяжёлой неонатальной патологией и/или протекают под маской таких состояний как сепсис, перинатальное поражение нервной системы, внутриутробная инфекция. Позднее выявление заболеваний этой группы может привести к тяжёлой инвалидности или даже летальному исходу. Установлено, что 5%** всех случаев «синдрома внезапной смерти младенцев» - следствие наследственных нарушений метаболизма. Однако некоторые из этих заболеваний эффективно лечатся при своевременной диагностике. Одним из современных методов диагностики нарушений метаболизма является тандемная масс-спектрометрия (ТМС). Этот метод позволяет определить в небольшом количестве биологического материала (капля высушенной крови) , что позволяет с определённой вероятностью заподозрить наследственное заболевание. В некоторых странах этим методом проводится обследование всех новорождённых на 10-30 наследственных нарушений метаболизма. Другими словами, все новорождённые подвергаются специальному биохимическому исследованию называемому скрининг. * Vilarinho L, Rocha H, Sousa C, Marcão A, Fonseca H, Bogas M, Osório RV. Four years of expanded newborn screening in Portugal with tandem mass spectrometry. J Inherit Metab Dis. 2010 Feb 23 ** Olpin SE The metabolic investigation of sudden infant death. Ann Clin Biochem, 2004, Jul 41 (Pt4), 282-293 **Opdal SH, Rognum TO The sudden Infant Death Syndrome Gene: Does It Exist? Pediatrics, 2004, V.114, N.4, pp. e506-e512 Что такое скрининг? Скрининг (от англ. Screening – просеивание) — это массовое обследование пациентов для выявления различных заболеваний, ранняя диагностика которых позволяет предотвратить развитие тяжёлых осложнений и инвалидности. На какие заболевания проводится обязательное скрининговое обследование новорождённых в нашей стране? В России существует государственная программа, которая включает в себя обязательное обследование (скрининг) всех новорождённых только на 5 наследственных заболеваний: фенилкетонурии (ФКУ), муковисцидоза, галактоземии, адреногенитального синдрома и врождённого гипотиреоза.

Обращаем Ваше внимание на то, что из этого перечня в состав исследования «ПЯТОЧКА» входит только скрининг на фенилкетонурию (полный перечень выявляемых наследственных болезней обмена веществ при помощи скринига «ПЯТОЧКА» см. ниже по тексту).

На какие заболевания можно обследовать ребёнка дополнительно? Скрининга новорождённых, направленного на диагностику нарушений метаболизма методом ТМС, в России на настоящий момент не проводится. В России это исследование пока проводится по назначению врача при наличии подозрений на наследственные болезни обмена веществ, хотя многие из заболеваний этой группы проявляют себя не сразу после рождения, но при этом уже есть у новорождённого. Однако, уже упомянутым ранее методом тандемной масс-спектрометрии (ТМС) можно дополнительно обследовать новорождённого ребенка на исключение 37 различных наследственных заболеваний, которые относятся к нарушениям обмена аминокислот, органических кислот и дефектам ß -окисления жирных кислот. Аминоацидопатии Аминоацидопатии развиваются вследствие недостатка специфических ферментов, необходимых для метаболизма аминокислот. Это приводит к аномально высокому уровню аминокислот и их производных в крови и моче, которые оказывают токсическое действие на клетки и ткани организма. Основные симптомы: задержка развития, судороги, коматозные состояния, рвота, диарея, необычный запах мочи, нарушения зрения и слуха. Лечение заключается в назначении специальной диеты и витаминов. Эффективность терапии зависит от того, насколько рано и точно установлен диагноз. К сожалению, некоторые заболевания из этой группы не поддаются лечению. Органические ацидурии/ацидемии Органические ацидурии/ацидемии являются результатом нарушения химического расщепления аминокислот вследствие недостаточной активности ферментов. Их клинические проявления схожи с проявлениями аминоацидопатий. Лечение заключается в назначении специальной диеты и/или витаминов. К сожалению, некоторые заболевания из этой группы не поддаются лечению. Дефекты ß-окисления жирных кислот ß-окисление жирных кислот – многоступенчатый процесс их расщепления, в результате которого образуется энергия, необходимая для жизнедеятельности клетки. Каждый шаг процесса окисления производится под действием специфических ферментов. При отсутствии одного из ферментов процесс нарушается. Симптомы: сонливость, кома, рвота, низкий уровень сахара в крови, поражение печени, сердца, мышц. Лечение заключается в назначении низкожировой диеты с частым и дробным кормлением, других специализированных диетических продуктов, а также, левокарнитина. Полный перечень выявляемых наследственных болезней обмена веществ

1. Болезнь с запахом кленового сиропа мочи (лейциноз).
2. Цитрулинемия тип 1, неонатальная цитрулинемия.
3. Аргининосукциновая ацидурия (АСА)/ недостаточность аргининосукцинат лиазы лиазы.
4. Недостаточность орнитин транскарбамилазы.
5. Недостаточность карбамилфосфат синтазы.
6. Недостаточность N-ацетилглютамат синтазы.
7. Некетотическая гиперглицинемия.
8. Тирозинемия тип 1.
9. Тирозинемия тип 2.
10. Гомоцистинурия/недостаточность цистатионин бета-синтетазы.
11. Фенилкетонурия.
12. Аргининемия/недостаточность аргиназы.
13. Пропионовая ацидемия (недостаточность пропионил КоА карбоксилазы).
14. Метилмалоновая ацидемия.
15. Изовалериановая ацидемия (недостаточность изовалерил КоА дегидрогеназы).
16. Недостаточность 2-метилбутирил КоА дегидрогеназы.
17. Недостаточность изобутирил КоА дегидрогеназы.
18. Глутаровая ацидемия тип 1 (недостаточность глутарил КоА дегидрогеназы тип 1).
19. Недостаточность 3-метилкротонил КоА карбоксилазы.
20. Множественная карбоксилазная недостаточность.
21. Недостаточность биотинидазы.
22. Малоновая ацидемия (недостаточность малонил КоА декарбоксилазы).
23. Недостаточность митохондриальной ацетоацетил КоА тиолазы.
24. Недостаточность 2-метил-3-гидроксибутирил КоА дегидрогеназы.
25. Недостаточность 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА лиазы.
26. Недостаточность 3-метилглутаконил КоА гидратазы.
27. Недостаточность среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы.
28. Недостаточность очень длинноцепочечной ацил-КоА дегидрогеназы.
29. Недостаточность короткоцепочечной ацил-КоА дегидрогеназы.
30. Недостаточность длинноцепочечной 3-гидроксиацил-КоА дегидрогеназы (дефект трифункционального белка).
31. Глутаровая ацидемия тип II (недостаточность глутарил КоА дегидрогеназы тип II), множественная недостаточность ацил-КоА дегидрогеназ.
32. Нарушение транспорта карнитина.
33. Недостаточность карнитин палмитоил трансферазы тип I.
34. Недостаточность карнитин палмитоил трансферазы тип II.
35. Недостаточность карнитин/ацилкарнитин транслоказы.
36. Недостаточность 2,4-диеноил КоА редуктазы.
37. Недостаточность среднецепочечной 3-кетоацил-КоА тиолазы.
38. Недостаточность средне-/короткоцепочечной ацил-КоА дегидрогеназы.

Материал для исследования: капиллярная кровь, собранная на специальную карточку-фильтр №903.

Литература

1. Chace D.H., Kalas T.A., Naylor E.W. The application of tandem mass spectrometry to neonatal screening for inherited disorders of intermediary metabolism. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2002; vol. 3; p. 17-45.
2. Leonard J.V., Dezateux C. Screening for inherited metabolic disease in newborn infants using tandem mass spectrometry. BMJ. 2002; vol. 324(7328); p. 4-5.
3. Millington D., Kodo N., Terada N., Roe D., Chace D. The analysis of diagnostic markers of genetic disorders in human blood and urine using tandem mass spectrometry with liquid secondary ion mass spectrometry.1991 Int.J.Mass Spectr.Ion Process. 111:211-28.
4. Chace D.H. Mass spectrometry in the clinical laboratory. Chem Rev. 2001 Feb;101(2):445-77.
5. Duran M., Ketting D., Dorland L., Wadman S.K. The identification of acylcarnitines by desorption chemical ionization mass spectrometry. J Inherit Metab Dis. 1985;8 Suppl 2:143-4.
6. Millington D.S., Kodo N., Norwood D.L., Roe C.R. Tandem mass spectrometry: a new method for acylcarnitine profiling with potential for neonatal screening for inborn errors of metabolism. J Inherit Metab Dis. 1990;13(3):321-4.
7. Chace D.H., DiPerna J.C., Mitchell B.L., Sgroi B., Hofman L.F., Naylor E.W.. Electrospray tandem mass spectrometry for analysis of acylcarnitines in dried postmortem blood specimens collected at autopsy from infants with unexplained cause of death. Clin Chem. 2001;47(7):1166-82.
8. Rashed M.S., Bucknall M.P., Little D., Awad A., Jacob M., Alamoudi M., Alwattar M., Ozand P.T. Screening blood spots for inborn errors of metabolism by electrospray tandem mass spectrometry with a microplate batch process and a computer algorithm for automated flagging of abnormal profiles. Clin Chem. 1997 Jul; 43(7):1129-41.
9. Millington D.S., Terada N., Chace D.H., Chen Y.T., Ding J.H., Kodo N., Roe C.R. The role of tandem mass spectrometry in the diagnosis of fatty acid oxidation disorders. Prog Clin Biol Res. 1992; 375:339-54.
10. Rashed M.S., Ozan P.T., Harrison M.E., Watkins P.J.F., Evans S. 1994. Electrospray tandem mass spectrometry in the analysis of organic acidemias. Rapid Commun. Mass Spectrom. 8:122-33
11. Vreken P., van Lint A.E., Bootsma A.H., Overmars H., Wanders R.J., van Gennip A.H. Rapid diagnosis of organic acidemias and fatty-acid oxidation defects by quantitative electrospray tandem-MS acyl-carnitine analysis in plasma. Adv Exp Med Biol. 1999; 466:327-37.
12. Griffiths W.J., Jonsson A..P, Liu S., Rai D.K., Wang Y. Electrospray and tandem mass spectrometry in biochemistry. Biochem J. 2001 May 1; 355(Pt 3):545-61.
13. Dooley K.C. Tandem mass spectrometry in the clinical chemistry laboratory. Clin Biochem. 2003 Sep; 36(6):471-81.
14. Михайлова С.В., Ильина Е.С., Захарова Е.Ю., Байдакова Г.В., Бембеева Р.Ц., Шехтер О.В., Захаров С.Ф. «Множественная карбоксилазная недостаточность, обусловленная мутациями в гене биотинидазы// Медицинская генетика. - 2005. - №2. - C. 633-638.
15. Байдакова Г.В., Букина А.М., Гончаров В.М., Шехтер О.В., Букина Т.М., Покровская А.Я., Захарова Е.Ю., Михайлова С.В., Федонюк И.Д., Колпакчи Л.М., Семыкина Л.И., Ильина Е.С. Диагностика наследственных болезней обмена веществ на основе сочетания методов тандемной масс-спектрометрии и энзимодиагностики, Медицинская генетика, 2005, т. 4, №1, с. 28-33.
16. Захарова Е.Ю., Ильина Е.С., Букина А.М., Букина Т.М., Захаров С.Ф., Михайлова С.Ф., Федонюк И.Д., Байдакова Г.В., Семыкина Л.И., Колпакчи Л.М., Зайцева М.Н. «Результаты проведения селективного скрининга на наследственные болезни обмена веществ среди пациентов психоневрологических отделений». Второй Всероссийский Конгресс, «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», Материалы Конгресса, стр. 141-142.
17. Baidakova G.V., Boukina A.M., Boukina T.M., Shechter O.V., Michaylova S.V. I’lina E.S, Zakharova E.Yu Combination of tandem mass spectrometry and lysosomal enzymes analysis - effective tool for selective screening for IEM in neurological clinic. SSIEM 41st Annual Symposium, Amsterdam, August 31- September 3, 2004.
18. Mikhaylova S.V., Baydakova G.V., Zakharova E.Y., Il’ina E.S. First cases of biotinidase deficiency in Russia. European Journal of Human Genetics Vol.13-Supplement1-May, 2005, p. 386.
19. Байдакова Г.В., Захарова Е.Ю., Зинченко Р.А. Недостаточность среднецепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы жирных кислот. Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков, Уфа, май 2005, Медицинская Генетика, т. 4, № 4, с. 153.
20. Захарова Е.Ю., Байдакова Г.В., Шехтер О.В., Ильина Е.С., Михайлова С.В. Тандемная масс-спектрометрия – новый подход диагностики наследственных нарушений обмена веществ, Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков, Уфа, май 2005, Медицинская Генетика, т. 4, №4, с.188.
21. Mikhaylova S.V., Zakharova E.Y, Baidakova G.V., Shehter O.V., Ilina E.S Clinical outcome of glutaric aciduria type I in Russia. J.Inherit. Metab.Dis 2007, v. 30, p. 38 22. Baydakova GV, Tsygankova PG. Diagnosis of mitochondrial β-oxidation defects in Russia. J Inherit Metab Dis (2008) 31 (Suppl 1) p.39

Подготовка

Что делать, если необходимо обследовать ребёнка на наследственные нарушения метаболизма?

• По назначению врача или самостоятельно в любом медицинском офисе ИНВИТРО необходимо заранее приобрести набор для проведения исследования, в который входит:

Подготовка к исследованию и правила взятия крови у новорождённых

1. Взятие образцов крови у новорождённых детей осуществляется в родовспомогательных учреждениях специально подготовленным сотрудником, а в случае ранней выписки новорождённого (до 4 дня жизни) - специально подготовленной патронажной сестрой.
2. При обследовании новорождённых взятие пробы крови следует проводить не ранее 4-х суток у доношенных и 7-х суток у недоношенных детей. У новорождённых кровь берут из пяточки, у детей старше 3 мес - из пальца.
3. У новорождённых от начала полного грудного или искусственного вскармливания до взятия крови должно пройти не менее 4-х суток. Взятие крови проводят через 3 часа после кормления (у новорождённых - перед очередным кормлением).
4. Перед взятием крови у новорождённого стопу ребёнка необходимо тщательно вымыть мылом, протереть стерильным тампоном, смоченным 70% спиртом, а затем обработанное место промокнуть стерильной сухой салфеткой!
5. Прокол делают одноразовым стерильным скарификатором на глубину 2,0 мм (зоны прокола изображены на ). Первую каплю крови удаляют стерильным сухим тампоном.
6. Мягким надавливанием на пятку способствуют накоплению второй капли крови, к которой перпендикулярно прикладывают специальную карточку из фильтровальной бумаги и пропитывают полностью и насквозь 5 зон, очерченных круговой линией. Пятна крови должны быть не меньше указанного на бланке размера, вид пятен должен быть одинаков с обеих сторон , . Никогда не используйте противоположную сторону фильтровальной бумаги для заполнения окружностей.
7. После взятия крови осушите зону прокола стерильным тампоном и наклейте бактерицидный пластырь на участок прокола. Внимание! От качества взятия крови зависит точность и достоверность исследования!
8. Специальную карточку из фильтровальной бумаги высушивают не менее 2 - 4 часов при комнатной температуре. Избегайте попадания прямых солнечных лучей! Для этого отведите внешний клапан карточки и подведите его край под противоположную поверхность фильтра (где не обозначены окружности), . После полного высыхания капель крови переместите клапан карточки над поверхностью фильтра. Подпишите Фамилию И. О. ребёнка внизу карточки (Name) и укажите дату взятия крови (Date), . Карточку поместите в маленький конверт и вложите его в предварительно подписанный большой конверт. Заполните направительный бланк заказа и также вложите его в большой конверт.
9. Передайте большой конверт в ближайший медицинский офис ИНВИТРО (конверт не запечатывается). Сотрудник ИНВИТРО в вашем присутствии проверит содержимое конверта и правильность заполнения бланка заказа.

Хранение и транспортировка: до и после взятия крови набор хранить при комнатной температуре в сухом месте; избегать контакта с системами отопления; избегать попадания прямых солнечных лучей; при транспортировке упаковать набор (наборы) в полиэтиленовый герметично закрывающийся пакет.

Показания к назначению

• Сходные случаи заболевания в семье.
• Случаи внезапной смерти ребёнка в раннем возрасте в семье.
• Резкое ухудшение состояния ребёнка после кратковременного периода нормального развития (бессимптомный промежуток может составлять от нескольких часов до нескольких недель).
• Необычный запах тела и/или мочи («сладкий», «мышиный», «варёной капусты», «потных ног» и др.).
• Неврологические нарушения - нарушения сознания (летаргия, кома), различные типы судорожных приступов, изменение мышечного тонуса (мышечная гипотония или спастический тетрапарез).
• Нарушения ритма дыхания (брадипноэ, тахипноэ, апноэ).
• Нарушения со стороны других органов и систем (поражение печени, гепатоспленомегалия, кардиомиопатия, ретинопатия).
• Изменения лабораторных показателей крови и мочи - нейтропения, анемия, метаболический ацидоз/алкалоз, гипогликемия/гипергликемия, повышение активности печёночных ферментов и уровня креатинфосфокиназы, кетонурия.
• Дополнительная диагностика 37 наследственных болезней обмена веществ наряду с обязательной государственной программой выявления 5-ти наследственных заболеваний: скрининг новорождённых: «ПЯТОЧКА».

Интерпретация результатов

Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Единицы измерения в лаборатории ИНВИТРО: мкмоль/литр. Референсные значения для определяемых параметров (детализированная интерпретация результатов)

Общая интерпретация результата

Что делать, если в результате исследования выявлено изменение показателей? Необходимо понимать, что изменения, выявленные при ТМС, полностью не подтверждают заболевание, а в ряде случаев, необходимо пройти дополнительные тесты, (см. список дополнительных тестов и ) чтобы убедиться в достоверности выявленных нарушений. Рекомендуется консультация врача-генетика и педиатра, чтобы выработать тактику совместных действий. Используемая литература (референсные значения)

1. Wiley V., Carpenter K., Wilcken B. Newborn screening with tandem mass spectrometry: 12 months’ experience in NSW Australia. Acta Paediatrica 1999; 88 (Suppl):48-51.
2. Rashed MS, Rahbeeni Z, Ozand PT. Application of electrospray tandem mass spectrometry to neonatal screening. Semin Perinatol 1999; 23:183–93.
3. Schulze A., Lindner M., Kohlmüller D., Olgemöller K., Mayatepek E., Hoffmann G.F. Expanded Newborn Screening for Inborn Errors of Metabolism by Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry: Results, Outcome, and Implications, Pediatrics, 2003; 111; 1399-1406.
4. Hoffman G., Litsheim T., Laessig R. Implementation of tandem mass spectrometry in Wisconsin’s newborn screening program. MMWR Morb MortalWkly Rep 2001; 50 (RR-3): 26–7.
5. Lin W.D., Wu J.Y., Lai C.C., Tsai F.J., Tsai C.H., Lin S.P., Niu D.M. A pilot study of neonatal screening by electrospray ionization tandem mass spectrometry in Taiwan. Acta Paediatr Taiwan 2001; 42:224–30.
6. Zytkovicz T.H., Fitzgerald E.F., Marsden D., Larson C.A., Shih V.E., Johnson D.M., et al. Tandem mass spectrometric analysis for amino, organic, and fatty acid disorders in newborn dried blood spots: a two year summary from the New England Newborn Screening Program. Clin Chem 2001;47:1945–55.

Общие принципы лабораторной диагностики наследственных болезней обмена веществ

На клиническом уровне диагноз НБО может быть только заподозрен, и дальнейшая диагностика целиком зависит от применения необычайно широкого спектра биохимических и молекулярно-генетических методов. В большинстве случаев только сочетанная интерпретация всех полученных результатов дает возможность точно определить форму заболевания.

Стратегия достоверной диагностики НБО включает несколько этапов: 1. Выявление дефектного звена метаболического пути посредством анализа (количественного, полуколичественного или качественного) соответствующих метаболитов; 2. Выявление дисфункции белка посредством оценки его количества и/или активности; 3. Выяснение природы мутации, т.е. характеристика мутантного аллеля на уровне гена.

Такая стратегия используется не только для решения научных проблем, касающихся изучения нормального метаболизма, молекулярных механизмов патогенеза НБО, выявления гено-фенотипических корреляций, она необходима прежде всего для практической диагностики НБО. Верифицировать диагноз на уровне белка и мутантного гена необходимо как для проведения пренатальной диагностики, медико-генетического консультирования отягощенных семей, так и в ряде случаев для назначения адекватной терапии. Например, при недостаточности дигидроптеридинредуктазы клинический фенотип и уровни фенилаланина будут неотличимы от классической формы ФКУ, но подходы к терапии этих заболеваний принципиально отличаются. Важность локусной дифференциации НБО для медико-генетического консультирования может быть продемонстрирована на примере мукополисахаридоза II типа (болезнь Хантера). По спектру экскретируемых гликозаминогликанов невозможно дифференцировать между собой мукополисахаридозы II, I и VII типов, но из этих заболеваний только болезнь Хантера наследуется по Х-сцепленному рецессивному типу, что имеет принципиальное значение для прогноза потомства в отягощенной семье. Безусловна приоритетность молекулярно-генетических методов при установлении гетерозиготного носительства, а также в пренатальной диагностике заболеваний, при которых мутантный фермент не экспрессируется в клетках ворсин хориона.

Этап исследования метаболитов

Оценка метаболитов в биологических жидкостях - необходимый этап диагностики аминоацидопатий, органических ацидурий, мукополисахаридозов, митохондриальных и пероксисомных болезней, дефектов метаболизма пуринов и пиримидинов и т.д. Хроматографические методы анализа играют важнейшую роль в диагностике НБО. Это обусловлено тем, что современный арсенал хроматографических технологий чрезвычайно широк и позволяет эффективно и информативно разделять сложные многокомпонентные смеси, к которым в том числе относится и биологический материал. Для селективного скрининга НБО успешно используется тонкослойная хроматография, позволяющая получать информацию на качественном уровне. Этот метод хроматографии применим для разделения аминокислот, пуринов и пиримидинов, углеводов, олигосахаридов. Для количественного анализа маркеров-метаболитов НБО успешно применяются такие хроматографические методы как газовая и высокоэффективная жидкостная хроматографии, а также хроматомасс-спектрометрия (ГХ, ВЭЖХ и ХМС соответственно). ГХ и ВЭЖХ являются универсальными методами разделения сложных смесей соединений, отличаются высокой чувствительностью и воспроизводимостью. В обоих случаях разделение осуществляется в результате различного взаимодействия компонентов смеси с неподвижной и подвижной фазами хроматографической колонки. Для ГХ подвижной фазой является газ-носитель, для ВЭЖХ - жидкость (элюент). Выход каждого соединения фиксируется детектором прибора, сигнал которого преобразуется в пики на хроматограмме. Каждый пик характеризуется временем удерживания и площадью. Следует отметить, что ГХ проводится, как правило, при высокотемпературном режиме, поэтому ограничением для ее применения является термическая неустойчивость соединений. Для ВЭЖХ не существует подобных ограничений, т.к. в этом случае анализ проводится в мягких условиях. ХМС представляет собой комбинированную систему ГХ или ВЭЖХ с масс-селективным детектором, что позволяет получать не только количественную, но и качественную информацию, т.е. дополнительно определяется структура соединений в анализируемой смеси.

Одним из перспективных направлений в развитии программ диагностики НБО является применение методов, позволяющих количественно определять множество метаболитов, являющихся маркерами разных групп НБО. К таким методам относится тандемная масс-спектрометрия (ТМС). ТМС позволяет охарактеризовать структуру, молекулярную массу и провести количественную оценку 3000 соединений одновременно. При этом не требуется длительной подготовки проб для проведения анализа (как, например, для ГХ), а время исследования занимает несколько секунд.

Этап исследования мутантных белков

Исследование мутантных белков может проводиться с помощью различных методов:

1. Определение активности фермента с применением естественных субстратов;
2. Определение активности фермента с использованием искусственных субстратов;
3. Нагрузка культивируемых фибробластов накапливаемыми субстратами;
4. Измерение концентрации белка с помощью иммунохимических методов.

Материалом для измерения активности ферментов при НБО являются прежде всего лейкоциты периферической крови: практически при всех лизосомных болезнях накопления, метилмалоновой ацидурии, некоторых гликогенозах. Для диагностики GM2-ганглиозидозов, недостаточности биотинидазы используют плазму или сыворотку крови. В некоторых случаях объектами исследования являются мышечная или печеночная ткань: ферменты дыхательной цепи митохондрий, гликогенозы. Также широко используется для диагностики культура кожных фибробластов.

Этап исследования мутантных генов

Развитие методов молекулярной биологии явилось настоящей революцией в области клинической биохимии. Разработка стандартных протоколов молекулярных исследований и автоматизация используемых методов являются сегодня законченным комплексом диагностических подходов и становятся наряду с биохимическими методами рутинной процедурой в клинических лабораториях. Быстрое развитие исследований в области расшифровки генома человека и определение ДНК- последовательности генов делает сейчас возможным ДНК-диагностику различных наследственных заболеваний. Методы ДНК-диагностики и анализа структуры нормальных генов и их мутантных аналогов при наследственных болезнях обмена начали использоваться в течение последнего десятилетия.

Для ДНК-диагностики наследственных заболеваний используются два основных подхода - прямая и косвенная ДНК-диагностика. Прямая ДНК-диагностика представляет собой исследование первичной структуры поврежденного гена и выделение мутаций, ведущих к заболеванию. Для детекции молекулярных повреждений в генах, обуславливающих наследственные болезни, используется стандартный арсенал методов молекулярной биологии. В зависимости от характеристики и типов мутаций, частот их встречаемости при различных наследственных заболеваниях, те или иные методы являются наиболее предпочтительными.

Для диагностики НБО в тех случаях, когда биохимический дефект точно известен, легко и достоверно определяем с использованием биохимических методик, ДНК-методы вряд ли займут приоритетное место. В этих случаях применение ДНК-анализа является скорее научно-исследовательским, а не диагностическим подходом. Однако после точно установленного диагноза методы ДНК-анализа будут полезны для последующей пренатальной диагностики, идентификации гетерозиготных носителей в семье и прогноза заболевания у гомозигот, а также для отбора больных с целью проведения казуальной терапии в будущем (фермент-заместительной и генотерапии). Также в случаях, когда биохимический дефект точно не известен, биохимическая диагностика затруднена, недостаточно достоверна или требует инвазивных методов исследования, методы ДНК-диагностики являются единственными и незаменимыми для точной постановки диагноза.

В общем виде тактика проведения диагностики НБО в каждом конкретном случае должна планироваться совместно с врачом-биохимиком и врачом-генетиком. Необходимыми условиями успешной и быстрой диагностики является понимание этиологии, механизмов патогенеза заболевания, знание специфических биохимических маркеров.