Какие структуры содержит кишечная палочка. Новый штамм E. coli оказался “супертоксичным” гибридом. Штаммы Escherichia coli - пробиотики и компоненты лекарств

Массовая вспышка инфекции E. coli типа О104 в Европе заразила более 1 800 человек и вызвала потенциально смертельное осложнение, известное как гемолитико-уремический синдром, у более чем 500 человек.

Вспышка преодолела границы, по крайней мере, 13 стран и убила около 20 человек.

Пока органы здравоохранения пытаются выявить очаги вспышки в продуктах питания, внимание международного сообщества сосредоточено на сложных траекториях, по которым сельскохозяйственная продукция следует в эпоху глобальной торговли.

На один из аспектов эпидемии, однако, обратили мало внимания: этот аномальный штамм устойчив ко многим видам антибиотиков .

Среди всех срочных вопросов, поднятых вспышкой эпидемии, эта устойчивость штамма заставляет бить во все колокола и побуждает к серьезному рассмотрению вопроса о сдерживании чрезмерного применения антибиотиков , вызванного инфекцией.

О резистентности штамма О104 вскользь упоминали, но скорее как о любопытном моменте, который отличает эту инфекцию, чем как о проблеме.

Это имеет большое значение, поскольку самый безопасный путь лечения инфекций, вызванных бактерией E. coli, также производит токсины , как и кишечная палочка.

Необходимо воздержаться от использования антибиотиков , поскольку, когда лекарственные препараты убивают бактерии, они производят токсины, которые могут вызвать худшие симптомы болезни.

Таким образом, поскольку антибиотики не могут быть использованы против инфекции E. coli, вопрос о том, будут ли они работать, стал предметом академического интереса – одного из многих, обсуждаемых в интернете исследователями-добровольцами, которые делают быстрые анализы по всему миру.

Даже если это не имеет отношения к нынешним жертвам, стоит обратить внимание на значительную устойчивость к антибиотику этой инфекции E. coli.

Отчасти потому, что Шига-токсин, который вырабатывает кишечная инфекция такого штамма, как O104:H4 и родственного ему намного более известного штамма O157:H7, обладает редкостной устойчивостью.

Хотя бы поэтому необходима разработка новых методов защиты от этого страшного врага.

Однако более важно то, что, по крайней мере, за десятилетие в Европе возникли новые резистентные факторы, которые повышают устойчивость штамма O104.

Их перемещение в штамм демонстрирует, что резистентные факторы могут неограниченно хаотически перемещаться среди организмов, как только они появляются.

И это должно подчеркнуть, как важно замедлить развитие устойчивости к антибиотику за счет сдерживания ненадлежащего использования антибиотиков в повседневной медицине и на сельскохозяйственных фермах.

По данным немецкого Института Роберта Коха, штамм O104 устойчив к более чем десяти антибиотикам восьми классов:
пенициллину
стрептомицину
тетрациклину
хинолону (налидиксовая кислота)
триметоприму/сульфаметоксазолу
трем поколениям сефалоспорина
амоксил/клавулановой кислоте
пиперациллин/сульбактам
пиперациллин/тазобактам.

Устойчивость к такому количеству препаратов свидетельствует о том, что в штамме O104 находится резистентная бактерия ESBL.

Действительно, согласно анализу Института Коха, штамм содержит два гена, которые вызывают эту резистентность - TEM-1 и CTX-M-15.

Это свойство бросает в дрожь врачей с 1990-х годов, когда штаммы резистентной бактерии ESBL и бактерии Klebsiella вызвали серьезные внутрибольничные инфекции, которые охватили Европу.

Поскольку изначально они поражали пациентов в отделениях интенсивной терапии, эти штаммы не вызвали большой тревоги в мире.

Но примерно в 2001 году эти резистентные факторы проникли в повседневную жизнь и вызвали панику.

Вследствие генетического перемещения, которое все время осуществляла бактерия, гены резистентности переместились в некоторые штаммы бактерии E. coli, попав не столько в пищу, создавая токсины, сколько распространившись вообще, вызывая инфекции мочевых путей и другие обычно нетяжелые заболевания.

Внезапно больницы в Бермингеме и Шропшире начали фиксировать значительные вспышки инфекции, вызванные бактериями E. coli и ESBL, а врачи, работающие в больницах, начали сообщать друг другу о молодых женщинах, которые страдают от рецидивных инфекций мочевого пузыря, которые могли вызвать новые препараты .

Это было явлением не только 2000-х годов.

В марте 2010 года университетская больница Северного Стаффордшира зафиксировала вспышку, вызванную бактериями ESBL и Klebsiella, вследствие которой пациент умер.

Откуда происходят эти резистентные факторы?

Развитие резистентности является неизбежным биологическим процессом; таким образом бактерия защищается от смертельных компонентов, не зависимо от того, выработаны ли эти компоненты другой бактерией или искусственно произведены в исследовательской лаборатории.

Однако чрезмерное применение антибиотиков ускоряет процесс и делает его результаты непредсказуемыми.

Это чрезмерное применение происходит в любое время, когда кто-либо принимает антибиотики при болезнях, для лечения которых они не подходят, таких как простуда или ушные инфекции .

Еще чаще это происходит, когда малые дозы антибиотиков добавляются на тонну продукции в агропромышленном комплексе, без какого-либо наблюдения и исследования возникающих вирусов .

Исследования в Испании и США свидетельствуют о связях между агрокультурным комплексом и возникновением бактерии ESBL: они выявили резистентную бактерию в мясе кур, продающихся в супермаркете.

Даже если исследователи определят овощи, которые могли послужить причиной возникновения вспышки инфекции, они никогда не смогут сказать, как резистентная бактерия попала в продукцию.

В 2006 году США пережили общенациональную вспышку кишечной инфекции штамма O157, бактериями которой был заражен свежий шпинат.

И хотя подозрение исследователей пало на навоз домашнего скота или диких свиней вблизи ферм, они так и не смогли выявить причины заражения.

Но мы уже знаем, почему возникает устойчивость к антибиотикам в этой вспышке и, учитывая беспорядочную склонность бактерии к перемещению генетического материала, мы знаем, что штамм O104 резистентен, поскольку содержит подобную бактерию, и может передавать ее другим типам инфекции.

Государствам и органам здравоохранения давно пора сделать все от них зависящее, чтобы замедлить развитие резистентности лекарственных препаратов, сдерживая чрезмерное применение антибиотиков по всему миру .

Кишечная палочка (E.coli) представляет собой грамотрицательные, палочковидные бактерии, которые обычно находятся в нижней части кишечника теплокровных (эндотермических) организмов. Большинство штаммов кишечной палочки безвредны, но некоторые серотипы являются патогенными и могут вызвать серьезное пищевое отравление у людей, и их наличие в продукции может даже повлечь за собой отзыв продуктов с рынка. Безвредные штаммы являются частью нормальной флоры кишечника, и могут быть полезны для организма, поскольку производят витамин К2 и предотвращают производство патогенных бактерий в кишечнике.

Введение

Кишечная палочка и родственные бактерии составляют около 0,1% от кишечной флоры, и фекально-оральный путь передачи является основным маршрутом, через который патогенные штаммы бактерии вызывают болезни. Клетки способны выживать вне тела в течение ограниченного промежутка времени, что делает их идеальными индикаторными организмами для тестирования проб окружающей среды относительно фекального загрязнения. Бактерия также может быть выращена легко и недорого в лабораторных условиях, и интенсивно исследуется на протяжении более 60 лет. Кишечная палочка является наиболее широко изученной прокариотической моделью организма, а также важным видов в области биотехнологии и микробиологии, где служит в качестве организма-хозяина для большей части работ с рекомбинантной ДНК. Немецкий врач-педиатр и бактериолог Теодор Эшерих обнаружили кишечную палочку в 1885 году, и теперь она классифицируется как часть семейства Enterobacteriaceae гамма-протеобактерий.

Серотипы

Патогенные штаммы E. coli могут быть категоризированы на основании элементов, которые могут вызывать иммунный ответ у животных, а именно: O антиген: часть липополисахаридного слоя K антиген: капсула H антиген: флагеллин Например, штамм Е. coli EDL933 принадлежит к группе O157: H7.

O антиген

Наружная мембрана клетки палочки Е. содержит миллионы молекул липополисахаридов (LPS), которые состоят из:

О антигена, полимера иммуногенных повторяющихся олигосахаридов (1-40 единиц)

Основная область фосфорилированных неповторяющихся олигосахаридов

Липид A (эндотоксин)

Антиген O используется для серотипирования кишечной палочки и эти обозначения группы O идут от O1 до O181, за исключением некоторых групп, которые исторически были удалены, а именно, O31, O47, O72, О67, O93 (ныне K84), O94 и O122; группы 174 до 181 являются предварительными (O174 = OX3 и O175 = OX7) или изучаются (от 176 до 181 – STEC / VTEC). Кроме того, существуют подтипы для многих групп O (например, O128ab и O128ac). Следует отметить, однако, что антитела по отношению к нескольким антигенам O перекрестно реагируют с другими антигенами O и частично с K антигенами не только из E.coli, но и от других видов бактерий Escherichia и вида Enterobacteriaceae. Антиген O кодируется генным кластером rfb. Рол (cld) ген кодирует регулятор длины липополисахаридной O-цепи.

K антиген

Кислый капсульный полисахарид (КПС) представляет собой толстый слизистый слой полисахарида, который окружает некоторые патогены E.coli. Существуют две отдельные группы K-антигеновых групп, называемые группа I и группа II (в то время как небольшая промежуточная группа (K3, K10 и K54 / K96) была классифицирована как группа III). Первая (I) группа состоит из 100 кДа (крупных) капсульных полисахаридов, а вторая (II) связана с внекишечными заболеваниями и имеет размер меньше 50 кДа. Группа IK антигенов обнаруживаются только с определенными О-антигенами (группы О8, O9, O20 и O101), далее они подразделяются на основании отсутствия (IA, аналогично видам Klebsiella в структуре) или присутствия (IB) аминосахаров и некоторые K-антигены группы I прикреплены к липидному А-ядру липополисахарида (KLPS), аналогичным образом, как антигены O (и, будучи структурно идентичны антигенам O, в некоторых случаях рассматриваются только как K антигены при совместной экспрессии с другим подлинным антигеном O). Антигены из группы II K напоминают антигены грам-положительных бактерий и сильно различаются по составу и далее подразделяются в соответствии с их кислотными компонентами. Как правило, 20-50% цепей КПС связаны с фосфолипидами. В общей сложности, насчитывается 60 различных K антигенов, которые были признаны (K1, K2A / переменного тока, К3, К4, К5, К6, К7 (= K56), К8, К9 (= O104), K10, K11, K12 (K82), K13 (= K20 и = K23), K14, K15, K16, K18a, K18ab (= K22), K19, K24, K26, K27, K28, K29, K30, K31, K34, K37, K39, K40, K41, K42 , K43, K44, K45, K46, K47, K49 (o46), K50, K51, K52, K53, K54 (= K96), K55, K74, K84, K85ab / акр (= O141), K87 (= O32), K92, K93, K95, K97, K98, K100, K101, K102, K103, KX104, KX105, и KX106).

H антиген

Антиген Н является основным компонентом жгутиков, участвующим в движении кишечной палочки. Он, как правило, кодируется геном FLIC. Существует 53 идентифицированных антигена H, пронумерованных от H1 до Н56 (Н13 и Н22 не были антигенами E.coli, но входят в группу Citrobacter freundii и было обнаружено, что Н50 – это то же самое, что H10).

Роль в развитии болезней

У людей и у домашних животных, вирулентные штаммы кишечной палочки могут вызывать различные заболевания. В организме человека: гастроэнтерит, инфекции мочевых путей, а также менингит у новорожденных. В более редких случаях, вирулентные штаммы также могут вызывать гемолитико-уремический синдром, перитонит, мастит, септицемию и грамотрицательную пневмонию.

Желудочно-кишечные инфекции

Каждая отдельная бактерия представляет собой округлый цилиндр. Некоторые штаммы кишечной палочки, такие как O157: H7, O104: H4, O121, O26, O103, O111, O145 и O104: H21, производят потенциально смертельные токсины. Пищевое отравление, вызванное кишечной палочкой, может быть вызвано употреблением в пищу немытых овощей или плохо разделанного и плохо приготовленного мяса. O157: H7 также печально известно благодаря тому, что вызывает серьезные и даже угрожающие жизни осложнения, такие как гемолитико-уремический синдром. Этот штамм связан со вспышками кишечной палочки 2006 года в США из-за свежего шпината. O104: H4 штамм является одинаково вирулентным. Против него не так хорошо развиты методы лечения антибиотиками и поддерживающие протоколы лечения (он может быть очень энтерогеморрагическим, как O157: H7, вызывая кровавый понос, но и более энтероагрегативным, то есть, он хорошо адгезируется и прилипает к кишечным мембранам). Этот штамм ответственен за смертельную вспышку кишечной палочки в Европе в июне 2011 года. Степень тяжести заболевания значительно варьирует; это может привести к летальному исходу, особенно у детей младшего возраста, пожилых людей или лиц с ослабленным иммунитетом, но чаще протекает в более мягкой форме. Ранее, в 1996 году, плохая гигиена при приготовлении мяса в Шотландии вызвала гибель семи человек из-за отравления кишечной палочкой, и сотни человек получили заражение. Кишечная палочка может питать как термостойких, так и термолабильных энтеротоксинов. Последние, названные LT, содержат одну А субъединицу и пять В субъединиц, расположенных в одном голотоксине, и в высокой степени сходны по своей структуре и функции с холерными токсинами. В субъединицы способствуют присоединению и вступлению токсина в кишечные клетки-хозяева, в то время как А субъединица расщепляется и предотвращает поглощению воды клетками, вызывая диарею. LT секретируется в ходе типа 2 пути секреции. Если бактерии кишечной палочки избегают желудочно-кишечного тракта через перфорацию (например, от язвы, разорванного аппендикса, или из-за хирургической ошибки) и проникают в живот, они обычно вызывают перитонит, который могут привести к летальному исходу без своевременного лечения. Тем не менее, кишечная палочка чрезвычайно чувствительна к таким антибиотикам, как стрептомицин или гентамицин. Последние исследования показывают, что лечение энтеропатогенной кишечной палочки антибиотиками может не улучшить исход заболевания, поскольку это может значительно увеличить вероятность развития гемолитического-уремического синдрома. E.coli в слизистой оболочке кишечника наблюдаются в повышенных количествах при воспалительных заболеваниях кишечника, болезни Крона и неспецифическом язвенном колите. Высокие количества инвазивных штаммов E.coli существуют в больших количествах в воспаленной ткани, а количество бактерий в воспаленных участках коррелирует с тяжестью воспаления кишечника. Желудочно-кишечные инфекции могут привести к развитию Т-клеток памяти, которые атакуют микробы кишечника в кишечном тракте. Пищевое отравление может вызвать иммунный ответ на микробные бактерии кишечника. Некоторые исследователи предполагают, что это может привести к воспалительным заболеваниям кишечника.

Вирулентность

Кишечная палочка E.coli (ЕС) классифицируется на основе серологических характеристик и свойств вирулентности. Виротипы включают: Энтеротоксигенная кишечная палочка (ETEC) является возбудителем диареи (без лихорадки) у человека, свиньи, овцы, козы, крупного рогатого скота, собак и лошадей. ETEC использует фимбриальные адгезины (проекции из бактериальной клеточной поверхности), чтобы связать клетки энтероцитов в тонком кишечнике. ETEC может производить два протеиновых энтеротоксина: Больший из этих двух белков, LT энтеротоксин, подобен холерному токсину по структуре и функциям. Меньший белок, ST энтеротоксин, вызывает скопление цГМФ в клетках-мишенях и последующую секрецию жидкости и электролитов в просвет кишечника. Штаммы ETEC являются неинвазивным, и они не оставляют просвета кишечника. ETEC является ведущей бактериальной причиной диареи у детей в развивающихся странах, а также наиболее частой причиной диареи путешественников. Каждый год ETEC вызывает более 200 миллионов случаев диареи и 380000 смертей, в основном, у детей в развивающихся странах. Энтеропатогенная кишечная палочка (ЕРЕС) является возбудителем диареи у людей, кроликов, собак, кошек и лошадей. Подобно ETEC, ЕРЕС также вызывает понос, но молекулярные механизмы колонизации и этиология различны. ЕРЕС не имеет ST и LT токсинов, но использует адгезин, известный как интимин, для связывания клеток кишечника хозяина. Этот виротип имеет множество факторов вирулентности, которые подобны Shigella, и может иметь токсин Шига. Связывание со слизистой оболочкой кишечника вызывает перегруппировку актина в клетке-хозяине, приводя к значительным деформациям. ЕРЕС клетки являются умеренно инвазивными (т.е. они проникают в клетки-хозяева) и вызывают воспалительную реакцию. Изменения ультраструктуры кишечных клеток из-за «привязанности и сглаживания», скорее всего, является основной причиной диареи у тех, кто страдает ЕРЕС. Энтероинвазивная кишечная палочка (EIEC) встречается только у людей. EIEC инфекция вызывает синдром, который идентичен дизентерии, с обильной диареей и высокой температурой. Энтерогеморрагическая E. coli (EHEC) содержится в организме человека, крупного рогатого скота и коз. Наиболее печально известным членом этого виротипа является штамм O157: H7, который вызывает кровавый понос без лихорадки. EHEC может вызвать гемолитико-уремический синдром и синдром внезапной почечной недостаточности. Он использует бактериальные фимбрии для прикрепления (общий пилус E.coli, ECP), умеренно инвазивен и обладает фаго-закодированным токсином Шига, который может вызывать интенсивную воспалительную реакцию. Энтероаггегантная E. coli (ЕАЭС) обнаружена только в организме человека называется так потому, что имеет фимбрии, которые агрегируют клетки культуры ткани. ЕАЭС связываются со слизистой оболочкой кишечника, вызывая водянистый понос без лихорадки. EAEC неинвазивны. Они производят гемолизин и энтеротоксин ST, подобно ЕТЕС. Адгезивно-инвазивные E. coli (AIEC) обнаружены в организме человека. AIEC способны вторгаться в эпителиальные клетки кишечника и размножаться внутриклеточно. Вполне вероятно, что AIEC способны более эффективно размножаться в организмах с дефектным врожденным иммунитетом. Они связаны со слизистой оболочкой кишечника при болезни Крона.

Эпидемиология инфекции желудочно-кишечного тракта

Передача патогенной кишечной палочки часто происходит фекально-оральным путем. Общие пути передачи включают в себя:. Негигиеничное приготовление пищи, фермерское загрязнение из-за навоза, орошение посевов загрязненной или грязной водой из неочищенных сточных вод, наличие одичавших свиней на пахотных землях, или прямое потребление сточных загрязненных вод. Молочный и крупный рогатый скот являются основными резервуарами кишечной палочки O157: H7, и они могут переносить его бессимптомно и распространять через свои фекалии. Пищевые продукты, связанные со вспышками E.coli, включают огурец, сырой мясной фарш, сырые ростки семян или шпинат, сырое молоко, непастеризованный сок, непастеризованный сыр и продукты, загрязненные инфицированными работниками пищевой промышленности фекально-оральным путем. В соответствии Управлением по безопасности продуктов питания и лекарственных средств США, фекально-оральный цикл передачи может быть нарушен при правильном приготовлении пищи, предотвращении перекрестного загрязнения, использовании барьеров, таких как перчатки, для пищевых работников, политика здравоохранения, обращение сотрудников пищевой промышленности за медицинской помощью, если они больны, пастеризация сока или молочных продуктов и соответствующие требования для мытья рук. Кишечная палочка, продуцирующая Шига токсин (STEC), в частности, серотип O157: H7, также передавался через мух, а также при непосредственном контакте с сельскохозяйственными животными, животными из мини-зоопарка, и частицами, распространяющимися в воздухе, в среде, где содержатся животные.

Инфекции мочевыводящих путей

Уропатогенные кишечные палочки (UPEC) являются причиной примерно 90% инфекций мочевыводящих путей (ИМП), наблюдаемых у людей с обычной анатомией. При восходящих инфекциях, фекальные бактерии колонизируют уретру и распространяются от мочевого тракта до мочевого пузыря, а также в почки (вызывая пиелонефрит), или простату у мужчин. Поскольку женщины имеют более короткий мочеиспускательный канал, чем мужчины, они в 14 раз чаще страдают от восходящих ИМП. Уропатогенные кишечные палочки используют P фимбрии (пиелонефрит-ассоциированные пили), чтобы связать уротелиальные клетки мочевых путей и колонизировать мочевой пузырь. Эти адгезины специфически связывают фрагменты D-галактоза-D-галактозы на антигене P групп крови эритроцитов и уроэпителиальных клетках. Примерно 1% населения Земли испытывает недостаток этого рецептора, и его присутствие или отсутствие опосредует восприимчивость или не восприимчивость человека к инфекции мочевых путей E.coli, соответственно. Уропатогенные кишечные палочки производят альфа- и бета-гемолизины, которые вызывают лизис клеток мочевых путей. Другим фактором вирулентности, который обычно присутствует в UPEC, является семейство Dr из адгезинов, которые особенно связаны с циститом и ассоциированным с беременностью пиелонефритом. Адгезины Dr связывают антиген Dr группы крови (DRA), который присутствует на распад ускоряющем факторе (DAF) на эритроцитах и других типах клеток. Там, Dr адгезины индуцируют развитие длинных клеточных расширений, которые обертываются вокруг бактерий, сопровождаясь активацией нескольких сигнальных каскадов, включая активацию PI-3-киназы. UPEC может обойти врожденную иммунную защиту организма (например, систему комплемента), вторгаясь в поверхностные клетки с образованием внутриклеточных бактериальных сообществ (ВБС). Кроме того, они обладают способностью к образованию K антигена, капсульных полисахаридов, которые способствуют образованию биопленки. Кишечные палочки, производящие биопленку, являются недостижимыми для иммунных факторов и антибактериальной терапии, и часто влияют на развитие хронических инфекций мочевых путей. Инфекции E.coli, производящие K антиген, обычно встречаются в верхних мочевых путях. Нисходящие инфекции возникают, хотя и сравнительно редко, когда клетки кишечной палочки входят в органы верхних мочевых путей (почки, мочевой пузырь или мочеточники) из потока крови.

Неонатальный менингит (NMEC)

Производится серотипом кишечной палочки, которая содержит капсульный антиген под названием K1. Колонизация кишечника новорожденного этими штаммами, которые присутствуют во влагалище матери, приводит к бактериемии, которая, в свою очередь, приводит к менингиту. И из-за отсутствия антител класса IgM от матери (они не пересекают плаценту, потому что FcRn опосредует только передачу IgG), к тому же, стоит учитывать также тот факт, что организм распознает антиген K1 как часть себя, поскольку он напоминает церебральные гликопептиды, и приводит к развитию серьезной степени менингита у новорожденных.

Роль в развитии рака или клеточном старении

Существуют некоторые штаммы кишечной палочки, которые содержат геномный остров поликетидсинтазы (PKS), чья функция заключается в кодировании мульти-ферментативного механизма, который производит генотоксическое вещество, называемое колибактин. Колибактин может вызывать клеточное старение или рак, повреждая ДНК. Тем не менее, барьер слизистой оболочки препятствует достижению E.coli поверхности энтероцитов. Только тогда, когда совместно с инфекцией E. coli развиваются некоторые воспалительные поражения, бактерия способна вводить колибактин в энтероциты, вызывая развитие опухоли.

Болезни животных

У животных, вирулентные штаммы E.coli вызывают различные заболевания, среди прочих – септицемия и диарея у новорожденных телят, острый мастит у молочных коров, колибактериоз также ассоциируется с хроническими респираторными заболеваниями с микоплазмой, вызывая перигепатит, перикардит, септические легкие, перитонит и т.д. у домашней птицы, и гниль Алабама у собак. Большая часть серотипов, выделенных из птицы, являются патогенными только для птиц. Таким образом, птичьи источники кишечной палочки не кажутся важными источниками инфекций у других животных.

Лабораторная диагностика

В образцах кала, микроскопия покажет грамотрицательные стержни, без особого расположения клеток. Затем, либо агар МакКонки или агар ЕМВ (или оба) высевают с калом. На агаре МакКонки, образуются темно-красные колонии, поскольку организм является лактозоположительным, и ферментация этого сахара приведет к падению среднего уровня рН, что приводит к потемнению среды. Рост на агаре EMB производит черные колонии с зеленовато-черным металлическим блеском. Это служит для диагностики кишечной палочки. Организм также лизин-положителен, и растет на TSI с (А / А / g + / H2S-) профилем. Кроме того, IMViC {+ + - -} для E.coli; поскольку он индол-положительный (красное кольцо) и метил красно-положительный (ярко-красный), но VP-отрицательный (без изменений-бесцветный) и цитрат-отрицательный (без изменений-зеленый цвет). В тестах для токсина могут использоваться клетки млекопитающих в культуре ткани, которые быстро убиваются токсином Шига. Несмотря на то, что этот метод чувствительный и очень специфический, он является медленным и дорогим. Как правило, диагноз делается при культивировании на сорбит МакКонки среде, а затем – с помощью типирования антисыворотки. Тем не менее, в настоящее время анализы латекса и некоторые типирования антисыворотки показали перекрестные реакции с колониями не-E.coli O157. Кроме того, не все штаммы кишечной палочки O157, связанные с HUS, являются несорбитольными ферментёрами. Государственный совет и Территориальные эпидемиологи рекомендуют клиническим лабораториям проводить скрининг, по крайней мере, всего кровавого стула на наличие этого патогена. Центры США по контролю и профилактике заболеваний рекомендуют, «весь стул, представленный для обычного тестирования у пациентов с острой внебольничной диареей (независимо от возраста больного, времени года, или присутствия или отсутствия крови в стуле) одновременно культивировать на E. coli O157:H7 (O157 STEC) и тестировать с помощью анализа, который обнаруживает токсины Шига для обнаружения не-O157 STEC».

Антибактериальная терапия и резистентность

Бактериальные инфекции обычно лечат с помощью антибиотиков. Тем не менее, чувствительности к антибиотикам у различных штаммов E.coli отличается друг от друга. В качестве грамотрицательного микроорганизма, кишечная палочка устойчива ко многим антибиотикам, которые эффективны против грамположительных микроорганизмов. Антибиотики, которые могут быть использованы для лечения инфекции E. coli, включают амоксициллин, а также другие полусинтетические пенициллины, много цефалоспоринов, карбапенемов, азтреонам, триметоприм-сульфаметоксазол, ципрофлоксацин, нитрофурантоин и аминогликозиды. Устойчивость к антибиотикам является растущей проблемой. Частично, это происходит из-за чрезмерного использования антибиотиков, но частично это, вероятно, связано с применением антибиотиков в качестве стимуляторов роста в кормах для животных. В исследовании, опубликованном в журнале Science в августе 2007 года, было установлено, что скорость приспособительных мутаций у E.coli составляет «порядка 10-5 на геном, за поколение, что в 1000 раз выше, чем предыдущие оценки». Это открытие может иметь значение для изучения и управления бактериальной резистентностью к антибиотикам. Устойчивые к антибиотикам кишечные палочки могут также передавать гены, ответственные за устойчивость к антибиотикам, к другим видам бактерий, таким как золотистый стафилококк, посредством процесса, называемого горизонтальный перенос генов. Бактерии E. coli часто несут несколько плазмид с лекарственной резистентностью, и в условиях стресса способны легко передавать эти плазмиды другим видам. В самом деле, E.coli является частым членом биопленки, где существует много видов бактерий в непосредственной близости друг от друга. Это смешение видов позволяет штаммам E.coli принимать и передавать плазмиды из других бактерий и обратно. Таким образом, E.coli и другие энтеробактерии являются важными резервуарами переводимой устойчивости к антибиотикам.

Штаммы бета-лактамазы

Устойчивость к бета-лактамным антибиотикам стала особой проблемой в последние десятилетия, поскольку штаммы бактерий, которые производят бета-лактамазы расширенного спектра, становятся все более распространенными. Эти ферменты бета-лактамазы делают многие, если не все, пенициллины и цефалоспорины неэффективными в качестве терапии. E.coli расширенного спектра, продуцирующие бета-лактамазы (ESBL E.coli), обладают высокой устойчивостью к массе антибиотиков, и инфекции, вызванные этими штаммами, трудно поддаются лечению. Во многих случаях, только два пероральных антибиотика и очень ограниченная группа внутривенных антибиотиков, остаются эффективными. В 2009 году, в Индии и Пакистане на бактерии E.coli был обнаружен ген под названием ген металло-бета-лактамазы Нью-Дели (сокращенно NDM-1), который дает резистентность даже к внутривенному антибиотику карбапенему. Повышенная озабоченность по поводу распространенности этой формы «супербактерии» в Соединенном Королевстве привела к призывам к дальнейшему мониторингу и стратегиям для борьбы с инфекциями и смертями по всей Великобритании. Тестирование к восприимчивости должно определять лечение всех инфекций, при которых организм может быть выделен для культуры.

Фаготерапия

Фаготерапия – использование вирусов, которые направленно воздействуют на патогенных бактерий, была разработана в течение последних 80 лет, в основном, в странах бывшего Советского Союза, где она использовалась для предотвращения диареи, вызванной кишечной палочкой. В настоящее время, фаготерапия для людей доступна только в центре фаготерапии в Республике Грузия и в Польше. Тем не менее, 2 января 2007 года FDA Соединенных Штатов дало одобрение для компании Omnilytics на применение фага, убивающего кишечную палочку O157: H7 для живых животных, которые будут зарезаны для потребления человеком. Фага энтеробактерии Т4, широко изученная фага, направлена на кишечную палочку.

Вакцинация

Исследователи активно работают над разработкой безопасных, эффективных вакцин для снижения случаев инфекции E. coli во всем мире. В марте 2006 года сообщалось, что вакцина, вызывающая иммунный ответ против палочки E. coli O157:H7 О-специфический полисахарид, конъюгированный с рекомбинантным экзотоксином А синегнойной палочки (O157- rEPA), является безопасной у детей от двух до пяти лет. Предыдущая работа уже указала, что она безопасна для взрослых. Планируется III фаза клинических испытаний, чтобы проверить крупномасштабную эффективность лечения. В 2006 году, Fort Dodge Animal Health (Уайет) представил эффективную, живую, ослабленную вакцину для борьбы с аэроциститом и перитонитом у кур. Вакцина представляет собой генетически модифицированную авирулентную вакцину, которая продемонстрировала защиту от O78 и нетипируемых штаммов. В январе 2007 года канадская биофармацевтическая компания Bioniche объявила о разработке вакцины для скота, которая уменьшает количество O157:H7 в навозе, на коэффициент 1000, то есть, убивет около 1000 патогенных бактерий на грамм навоза. В апреле 2009 года исследователь Университета штата Мичиган объявил, что он разработал рабочую вакцину для штамма E.coli. Доктор Махди Саид, профессор эпидемиологии и инфекционных заболеваний в колледжах ветеринарной медицины и медицины человека Университета штата Мичиган, подал патентную заявку на свое открытие и вступил в контакт с фармацевтическими компаниями для её коммерческого производства.

Изобретение относится к биотехнологии, касается получения продуцентов для пробиотических препаратов - бактерийных препаратов на основе живых культур микроорганизмов-симбионтов, используемых для профилактики и лечения дисбактериозов и других расстройств желудочно-кишечного тракта. В штамм Escherichia coli М17 - продуцент для пробиотического препарата колибактерин - введена неконьюгативная, немобилизуемая плазмида p Сolap, несущая гены продукции колицина Е1 и детерминант устойчивости к ампициллину в дозах до 150 мг/л. Полученный штамм лишен нежелательного адгезивного фенотипа инактивированием гена адгезина fimH пилей 1-го типа интеграцией гена устойчивости к канамицину - неомицину npt. Штамм E.coli М17 fim H::Kan/p Colap депонирован в ВКПМ под номером В-7448, Это позволяет создать пробиотический препарат со сниженной способностью к колонизации отличных от интестинальной ниш, с повышенной антагонистической активностью и резидентный на фоне антибиотикотерапии. Введенные в сконструированный штамм признаки стабильно сохраняются в популяции. Это облегчает получение стандартного препарата на основе штамма и гарантирует, что при приеме препарата пациентом без сопутствующей антибиотикотерапии не произойдет элиминация плазмиды. 4 ил., 1 табл.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и касается создания усовершенствованного штамма Escherichia coli, который может быть использован для получения пробиотиков - бактерийных препаратов на основе живых культур микроорганизмов-симбионтов. Пробиотики (другие названия препаратов данной группы: нормофлоры, эубиотики, микробиотики) являются эффективным средством для профилактики и лечения дисбактериоза кишечника. Дисбактериоз - это выраженное изменение в видовом и количественном соотношении микробов, которое проявляется в бурном развитии условно-патогенных микроорганизмов, в частности бактерий семейства кишечной группы (Enterobacteriaceae), и сопровождается различными болезненными проявлениями. Важной причиной дисбактериозов является применение антибиотиков и других противомикробных препаратов [Красноголовец В. Н. "Клиническое значение дисбактериоза кишечника, развившегося в результате применения антибиотиков". В кн. "Применение колибактерина для профилактики и лечения кишечных заболеваний и технология его производства". М., 1967, с. 223 - 243]. В настоящее время в России известны препараты пробиотиков "Колибактерин" и "Бификол", которые получают на основе штамма Escherichia coli М17, который, по-существу, является производным штамма Е.coli, выделенного А. Ниссле и используемого для получения препарата "Mutaflor" (Германия) [Перетц Л.Г. "Сухой колибактерин. Новые методы диагностики, лечения и профилактики кишечных заболеваний". В кн. "Тезисы докладов Пленуму Уч. мед. сов. МЗ РСФСР". М., 1961, с. 52-54]. Однако, в отличие от исходного штамма штамм Е. coli М17 утратил способность к синтезу колицина B и, следовательно, снизил свою антагонистическую активность в отношении бактерий кишечной группы [Шемчук Л.Ф. "Стандартизация колибактерина", автореф. канд.б.н., М., 1983, с. 16]. Другим недостатком штамма Е.coli М17 и его предшественника является наличие у них высокоадгезивного М н фенотипа фимбрий 1-го типа, необычного и нежелательного для кишечного штамма. Такой фенотип часто обнаруживается у выделяемых из макроорганизма штаммов при инфекции мочевыводящих путей и внутрибольничной пневмонии [Сокуренко Е.В., Чеснокова В.Л. "Способ модификации адгезивного фенотипа диких изолятов Е. coli в применении к штаммам - продуцентам препарата колибактерин". Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1997, Том 124, N 9, с. 334 - 338]. Недостатком штамма E.coli М17 является также чувствительность его к антибиотикам. Поэтому препараты на его основе не могут быть эффективными на фоне приема антибиотиков. Между тем одновременное применение антибиотиков и пробиотиков может предотвращать развитие дисбактериоза и тем самым повышать эффективность терапевтических мероприятий, сокращать сроки лечения. Задачей изобретения является создание штамма Е.coli - производного E.coli М17, который позволяет устранить упомянутые выше недостатки известного штамма Е. coli М17, а именно: пониженная антагонистическая активность, нежелательный адгезивный фенотип, чувствительность к антибиотикам. Технический результат состоит в конструировании штамма с повышенной антагонистической активностью, сниженной способностью к колонизации отличных от первичной интестинальной ниш в макроорганизме и с резистентностью к умеренным дозам антибиотиков пенициллинового ряда. Указанная цель достигается тем, что с помощью генетических и генно-инженерных методов конструируют штамм Е.coli М17 fimH::kan/pColap, который продуцирует колицин E1, устойчив к умеренным концентрациям ампициллина (до 150 ЕД/мл) и содержит инактивированный ген fimH, кодирующий фимбриальный адгезин. Штамм Е.coli М17 fimH::kan/pColap депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером В-7448. В основе патентуемой конструкции штамма лежат следующие положения. Нами впервые показано, что инактивирование гена адгезина fimH пилей 1-го типа в геноме Escherichia coli штамма М17 и введение в штамм Escherichia coli М17 неконьюгативной, немобилизуемой плазмиды pColap, несущей гены продукции колицина E1 и детерминант устойчивости к ампициллину в дозах до 150 мг/л позволяет создать пробиотический препарат со сниженной способностью к колонизации отличных от интестинальной ниш, с повышенной антагонистической активностью и резидентный на фоне антибиотикотерапии. Сущность патентуемого генно-инженерного решения поясняется чертежами, где:

На фиг. 1 показана схема получения рекомбинантного штамма E. coli M17fimH::kan/pColap с дефектом в гене адгезина fimH пилей 1-го типа,

На фиг. 2 - схема конструирования гибридной плазмиды pColap,

На фиг. 3 приведены результаты исследования адгезивной активности сконструированного штамма Escherichia coli М17 fimH::kan/pColap,

На фиг. 4 - результаты исследования стабильности сконструированного штамма Escherichia coli М17 fimH::kan/pColap. При получении штамма Е.coli М17 fimH::kan/pColap в качестве исходного использовали его ближайший аналог - штамм Е.coli М17. Для элиминации фимбриального адгезина, сообщающего клеткам Е.coli М17 нежелательный высокоадгезивный М н фенотип, получали рекомбинантный штамм, у которого в хромосомный ген fimH, кодирующий адгезин, был интегрирован ген устойчивости к канамицину-неомицину npt. С этой целью использовали плазмиду pCH103, производную плазмиды R6K, которая имеет pir-зависимую систему репликации и может поддерживаться только в штаммах, содержащих ген pir, обеспечивающий ее репликацию [Сокуренко Е.В., Чеснокова В.Л. "Способ модификации адгезивного фенотипа диких изолятов Е.coli в применении к штаммам - продуцентам препарата колибактерин". Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1997, Том 124, N 9, с. 334 - 338]. Плазмида pCH103 несет ген устойчивости к ампициллину и фрагмент хромосомы, содержащий гены fim-кластера, в котором целостность гена fimH нарушена вставкой гена устойчивости к канамицину (неомицину) npt. После трансформации ее в штамм Е.coli М17 она не может поддерживаться в клетках, и устойчивые к канамицину трансформанты могут возникать или при интеграции ее целиком в хромосому в результате одного кроссинговера или в результате двойного кроссинговера (фиг. 1). Трансформанты второго класса остаются чувствительными к ампициллину. Среди них был отобран штамм, обозначенный Е.coli M17fimH::kan (или М17 fimH::npt). Проведенное исследование подтвердило отсутствие у полученного штамма маннозо-чувствительной адгезии, т.е. FimH - фенотип. Для повышения антагонистической активности штамма Е. coli М17 и придания ему устойчивости к ампициллину на основе плазмиды ColE1 известными методами ["Методы молекулярной генетики и генной инженерии", 1990, Новосибирск, "Наука", Сибирское отделение, с. 7-10, 39-44] была сконструирована гибридная плазмида pColap (фиг. 1). Исходная плазмида ColE1, выделенная из непатогенного штамма Е.coli, детально изучена. Она имеет довольно узкий круг хозяев (в основном - штаммы кишечной палочки) и стабильно поддерживается в бактериальных клетках. Известны ее полная нуклеотидная последовательность, функции всех ее генетических элементов, регуляция их активности. Плазмида детерминирует синтез колицина E1, который губительно действует на клетки родственных бактерий. Недостатком плазмиды ColE1 является ее способность к мобилизации в другие клетки с помощью конъюгативных плазмид, которая обусловлена присутствием в ее структуре mob-области. Используя эндонуклеазу рестрикции BspLu11.1, эту область полностью удалили и при этом практически не затронули другие генетические элементы плазмиды. Затем, используя эндонуклеазу рестрикции BspH1, из известного вектора pUC19 вырезали фрагмент, содержащий ген b1a, кодирующий синтез - лактамазы, и лигировали его с фрагментом плазмиды ColE1, лишенным mob-области. В результате получили плазмиду pColap. Эта плазмида неконъюгативна и немобилизуема и, следовательно, практически не может быть передана в клетки других бактерий. В отличие от вектора pUC19 и других плазмид pColap обеспечивает только умеренный уровень устойчивости к ампициллину трансформированным ею штаммам Е.coli (табл. 1). Такое ухудшение экспрессии гена - лактамазы наблюдается из-за нарушений в промоторной области гена (боксе Гильберта) и 5" - участке, повышающем эффективность экспрессии , произошедших в результате генетических манипуляций в процессе конструирования рекомбинантной плазмиды pColap. Чувствительность штаммов, несущих pColap, к повышенным концентрациям антибиотика следует считать благоприятным фактором. Так, если по каким-либо причинам присутствие штаммов, содержащих эту плазмиду, в кишечнике пациента становится нежелательным или если в результате какого-либо исключительного события плазмида переносится в другой штамм, то все клетки, содержащие ее, можно элиминировать из организма, применив высокие концентрации -лактамных антибиотиков. Плазмидой pColap трансформировали штамм Е. coli М17 fimH::kan и получили штамм Е.coli М17 fimH::kan/pColap. Штамм имеет следующие характеристики. Морфология. Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами 1,5 - 2 мкм в длину. Культурально-физиологические признаки. Мясо-пептонный агар и агаризованный бульон Хотингера. Через 36 ч роста при 37 o C образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5 - 2,5 мм, поверхность колоний гладкая, края ровные, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируются. Агаризованная минимальная среда М9 с глюкозой (0,2%). Через 40 ч роста образует колонии 1-2 мм в диаметре, серовато-беловатые, полупрозрачные, круглые, выпуклые, с ровными краями. Мясо-пептонный бульон и бульон Хотингера. Через 18-24 ч роста при 37 o C наблюдается сильное равномерное помутнение, небольшой осадок, характерный запах. Жидкая минимальная среда М9 с глюкозой (0,2 %). Через 20-24 ч роста с аэрацией наблюдается сильное равномерное помутнение, запах слабый или отсутствует. Рост по уколу в мясо-пептонном агаре. Хороший рост по всему уколу. Микроорганизм является факультативным анаэробом. Отношение к температуре и pH среды. Хорошо растет при температуре от 30 до 42 o C и при pH 6,8 - 7,2. Биохимические свойства. Хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, маннозу, ксилозу, маннит и сорбит с образованием кислоты и газа. Рамнозу, галактозу и арабинозу - со слабым кислотообразованием; салицин - с замедленным кислото- и газообразованием; рафинозу - только с кислотообразованием. Инозит не усваивает. Сероводород не образует; индол вырабатывает. Отношение к антибиотикам. Устойчив к ампициллину при концентрациях в среде до 150 мг/л. Продукция бактериоцинов. Продуцирует колицин E1. Содержание плазмид. Клетки содержат многокопийную неконъюгативную и немобилизуемую плазмиду pColap (5239 п.н.), детерминирующую устойчивость к ампициллину и синтез колицина E1. Штамм имеет антигенную формулу О2:L1:H6 и агглютинируется сывороткой при титре сыворотки не ниже 1:64000. Изобретение иллюстрируется примерами, которые характеризуют устойчивость штаммов, несущих различные плазмиды, к ампициллину, стабильность их признаков в процессе культивирования. Пример 1. Изучение роста штамма Е. coli М17 и его производных, содержащих плазмиды, на средах с разными концентрациями ампициллина (табл. 1). Исследуемые штаммы кишечной палочки (таблица 1) выращивались в течение 18 ч в бульоне Луриа (LB - 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на 1 л дистиллированной воды) при 37 o C с аэрацией. Затем готовили последовательные разведения бактериальных культур до 10 -7 в физиологическом растворе и высевали каждую культуру на чашки с LA (LB + 1,6 % агар), содержащие ампициллин в следующих концентрациях (мкг/мл): 5, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250. Оценку роста колоний производили через 18-24 ч. Результаты представлены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, исходный штамм кишечной палочки М17 проявляет высокую чувствительность к ампициллину. Плазмида pUC19, содержащаяся в штамме М17/pUC19, которая явилась источником гена - лактамазы для сконструированной нами плазмиды pColap, придает бактериальной клетке устойчивость к концентрациям ампициллина до 2 г/л. В то же время плазмида pColap, содержащаяся в штамме М17 fimH::kan/pColap, обеспечивает устойчивость к концентрациям ампициллина не выше 150 мг/л. Таким образом, полученные штаммы обладают умеренным уровнем устойчивости к ампициллину. Пример 2. Исследование адгезивных свойств и определение адгезивного фенотипа штамма Е. coli М17 и его производных. Адгезивный фенотип определяли стандартным методом "исследования роста" . Из свежей культуры исследуемых штаммов бактерий готовили суспензию бактериальных клеток в физиологическом растворе с оптической плотностью 1.0 при длине волны 540 нм. Параллельно приготовили планшеты для микротитрования с плоскодонными лунками с иммобилизованными в лунках субстратами для адгезии, а именно: МН (дрожжевой маннан), РН (бычья РНКаза В) и БСА (бычий сывороточный альбумин). Затем бактериальную суспензию помещали в лунки и инкубировали в течение 40 мин. Несвязавшиеся бактериальные клетки тщательно отмывали физиологическим раствором. В лунки добавляли богатую питательную среду и инкубировали с постоянным перемешиванием при 37 o C в течение 2,5 - 3 ч до появления помутнения в лунках. Оптическая плотность в каждой лунке учитывалась на автоматическом ридере микропланшет (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, Calif., USA). В данном эксперименте исследовались следующие штаммы Е.coli: М17 - исходный штамм; М17 fimH::kan - штамм М17 с инактивированным геном адгезина fimH: М17 fimH: : kan/pPKL91 - штамм fimH::kan, трансформированный плазмидой pPKL91, содержащей регуляторный ген fimB, включающий экспрессию пилей 1-го типа бактериальной клеткой; штамм M17fimH::kan/pColap - штамм М17 fimH::kan, трансформированный сконструированной нами плазмидой pColap, несущей детерминанты устойчивости к ампициллину и продукции колицина Е1. Результаты исследования адгезивной активности штаммов Е.coli М17 и производных штамма Е.coli М17, оцененной с помощью метода "исследования роста", представлены на фиг. 3 (по оси ординат отложены значения оптической плотности при длине волны 540 нм; на оси абсцисс - исследуемые штаммы Е. coli: 1 - М17; 2 - М17 fimH::kan, 3 - M17fimH::kan/pPKL91, 4 - М17 fimH::kan/pColap). Как видно из фиг. 3, исходный штамм Е. coli М17 хорошо связывается и с РНКазой B, и с маннаном, что указывает на МН адгезивный фенотип, нежелательный для интестинального штамма кишечной палочки. Полученный нами рекомбинантный штамм М17 fimH::kan проявляет нулевую адгезивную активность как сам по себе, так и после введения в него плазмиды, включающей экспрессию пилей 1-го типа. Нулевая адгезиная активность сохраняется в этом штамме и после введения в него плазмиды pColap (штамм М17 fimH::kan/pColap). Пример 3. Исследование стабильности признаков штамма Escherichia coli М17 fimH::kan/pColap, детерминируемых плазмидой pColap. Сконструированная нами плазмида pColap обеспечивает продукцию колицина Е1 и устойчивость к ампициллину. Сохранение этих признаков зависит от стабильности поддержания плазмиды в клетках бактерий: утрата плазмиды сопровождается утратой соответствующих признаков. Определяли стабильность сохранения устойчивости к ампициллину и колициногенности полученных штаммов при культивировании их в жидкой питательной среде в отсутствие селективного агента на протяжении 100 генераций. В качестве положительного контроля использовали исходную плазмиду ColE1, а отрицательного - плазмиду pBR322, производную ColE1, не содержащую локуса cer, который влияет на стабильность плазмид. Культуры штаммов М17 fimH::kan/pColap, М17/ColЕ1 и M17/pBR322 выращивались в течение 18 ч с усиленной аэрацией при 37 o C в LB с ампициллином (100 мкг/мл). Штамм М17/ColЕ1 выращивали в тех же условиях, но без ампициллина. Полученные культуры содержали примерно 10 o бактериальных клеток в 1 мл. Затем в пробирки с 10 мл LB (без добавленного антибиотика) вносили 10 мкл (10 6) соответствующей бактериальной культуры. Полученную суспензию выращивали, как описано выше. При таком культивировании бактериальные клетки успевали пройти 10 делений. Повторив эту операцию 10 раз, мы получили бактериальную культуру, прошедшую 100 генераций с момента первого засева в среду без селективного агента. Перед каждым засевом отбирались пробы бактериальной культуры и проверялись на наличие свойств устойчивости к ампициллину и продукции колицина. Для этого суспензии клеток рассевались на чашках с LA до получения отдельных колоний. Затем по 100 колоний каждого штамма проверялись на способность к росту на той же среде в присутствии ампициллина (100 мкг/мл). Кроме того, колонии проверялись на способность продуцировать колицин Е1. Для этого использовался тест с нанесением верхнего агара (Миллер Дж. "Эксперименты в молекулярной генетике", М. , "Мир", 1976, стр. 183-189). Тест заключается в следующем: на чашки с твердой питательной средой, содержащей 1,6 % агар, репликатором или зубочисткой перекалывают исследуемые колонии. Чашки инкубируют при 37 o C в течение 3 - 4 ч, индуцируют продукцию колицина облучением ультрафиолетом в течение 4-5 с и инкубируют в тех же условиях в течение ночи. Затем клетки лизируют парами хлороформа при комнатной температуре в течение 30 - 40 мин. Важно проследить, чтобы на следующем этапе весь хлороформ выветрился из чашки. Наслаивают на нижний слой агара 3 - 5 мл полужидкого (0,7 %) агара, содержащего 10 7 /мл бактериальных клеток тест-штамма Е. coli (чувствительного к колицину Е1). Инкубируют ночь при 37 o C. Регистрируют наличие зон просветления в слое тест-культуры вокруг пятен исследуемых штаммов. Результаты исследования стабильности сконструированного штамма Escherichia coli М17/pColap приведены на фиг. 2 (ColE1 соответствует штамму М17/ColЕ1, pBR322 - штамму M17/pBR322, pColap - штамму М17/pColap). Присутствие плазмиды в бактериальной клетке следует из сохранения ею исходных свойств (колициногенности и/или устойчивости к ампициллину). Результаты эксперимента (фиг. 2) свидетельствуют, что лишенная cer локуса плазмида pBR322 быстро элиминируется из бактериальной популяции при выращивании в среде, лишенной антибиотика, в то время как две другие плазмиды (исходная ColE1 и рекомбинантная pColap) стабильно наследуются клетками в этих условиях. Это свойство является одним из важным преимуществ нашей конструкции, поскольку, с одной стороны, облегчает получение стандартного препарата на основе штамма, содержащего pColap, а с другой стороны, гарантирует, что при приеме препарата пациентом без сопутствующей антибиотикотерапии не произойдет элиминация плазмиды. Промышленная применимость. Приведенное описание способа конструирования патентуемого штамма Escherichia coli М17 rimH::kan/pColap достаточно для повторного получения штамма с использованием стандартных методик, реагентов и оборудования, применяемых в генно-инженерных исследованиях.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ