Perubahan kombinasi. Transduksi, transformasi dan konjugasi. Rekombinasi genetik (transduksi, konjugasi, transformasi), mekanisme dan signifikansinya dalam variabilitas Mekanisme transmisi informasi genetik transformasi konjugasi transduksi

REKOMBINASI GENETIK pada eukariota terjadi selama reproduksi seksual melalui pertukaran fragmen kromosom, dengan dua kromosom rekombinan terbentuk dari dua kromosom induk, yaitu. dua individu rekombinan muncul.

Prokariota tidak memiliki reproduksi seksual Þ sebagai akibat dari penataan ulang intragenomik: perubahan lokalisasi gen di dalam kromosom, atau ketika bagian DNA donor menembus # penerima → pembentukan merozigot, mis. hanya SATU REKOMBINASI yang terbentuk.

GeneR terjadi dengan partisipasi enzim dalam gen individu atau kelompok hubungan gen. Ada REC GENES khusus yang menentukan kemampuan bakteri untuk bergabung kembali. Transfer materi genetik dari B! ke B! terjadi melalui transformasi, transduksi dan konjugasi, dan gen plasmid - melalui transduksi dan konjugasi.

TRANSFORMASI – pemindahan langsung materi genetik(Fragmen DNA) donor Rec#. (Untuk pertama kalinya, Griffiths bereksperimen dengan strain pneumokokus nonkapsular hidup yang avirulen, yang menjadi ganas ketika diobati dengan ekstrak pneumokokus kapsuler yang dimatikan.)

Biasanya hanya satu gen yang ditransfer dari DNA donor ke sel penerima, karena Fragmen DNA yang dapat menembus Rec# sangat kecil. Hanya sebagian dari sel B yang dapat diubah!! populasi – KOMPETEN. Keadaan kompetensi (ketika dinding B! permeabel terhadap fragmen DNA polimer tinggi (Mg = 0,5–1 juta)) biasanya terjadi pada akhir FASE LOG.

Tahapan proses transformasi:

1) adsorpsi DNA donor pada Rec#;

2) penetrasi DNA ke dalam Rec# dan despiralisasi DNA.

3) hubungan salah satu dari dua untai DNA donor dengan daerah homolog dari kromosom penerima dan rekombinasi selanjutnya.

Efisiensi tergantung pada DERAJAT HOMOLOGI antara DNA donor dan penerima, yang menentukan hasil akhir, yaitu jumlah rekombinan (transforman) yang terbentuk; transformasi interspesifik terjadi jauh lebih jarang daripada transformasi intraspesifik.

TRANSDUSI– transfer materi genetik menggunakan fag. Ada tiga jenis transduksi:

Nonspesifik (umum). Pada saat partikel fag berkumpul, fragmen DNA APAPUN dari donor dapat menembus ke dalam kepalanya. Setiap gen donor ditransfer bersama dengan DNA fag dan dimasukkan ke dalam wilayah homolog DNA Rec# melalui rekombinasi. Fag hanya mentransfer materi genetik

Spesifik– fag mentransfer gen TERTENTU ketika profag dibelah dari B! kromosom bersama dengan gen di dekatnya, dan fag menjadi rusak. Ketika fag berinteraksi dengan Rec#, gen donor dan fag yang rusak dimasukkan ke dalam kromosom RecB!, dan B!! menjadi kebal terhadap infeksi berikutnya oleh fag yang mematikan.

Gagal– fragmen DNA bakteri donor tidak termasuk dalam kromosom RecB!, tetapi terletak di sitoplasma dan berfungsi dalam bentuk ini. Selama pembelahan, potongan DNA ini diteruskan hanya ke satu anak perempuan # dan akhirnya hilang pada keturunannya.

KONJUGASI– transfer materi genetik dari sel donor ke sel penerima selama CROSSING mereka. Donor – ## dengan F-plasmid (faktor jenis kelamin). Saat menyilangkan F+ dengan F–#, faktor jenis kelamin ditransmisikan terlepas dari kromosom donor, dan hampir semua Rec# menjadi F+.

Plasmid F dapat berintegrasi ke dalam B! kromosom. Dalam beberapa kasus, ia dilepaskan, sambil menangkap B yang terhubung dengannya! gen (ditunjuk oleh gen termasuk: F-lac).

1) melampirkan sel donor ke Rec# menggunakan SEX-PILES

2) pembentukan JEMBATAN konjugasi, melalui mana faktor F dan plasmid lain yang terletak di sitoplasma donor ditransmisikan.

3) pemutusan salah satu rantai DNA (di tempat masuknya F-plasmid) dengan partisipasi endonuklease. Salah satu ujung DNA menembus Rec# dan segera diselesaikan menjadi struktur 2 untai. Selama transfer, sebagian DNA donor ditangkap - strain Hfr (FREKUENSI REKOMBINASI TINGGI). Ketika strain Hfr disilangkan dengan F–#, faktor F tidak ditransmisikan (karena jembatan konjugasi putus, dan faktor F terletak di bagian distal kromosom). Hanya gen B yang diturunkan! kromosom terletak di dekat awal transfer (titik O (asal)).

4) Pada untai DNA SISA #, 2 rantai disintesis.

22. Spora dan sporulasi pada mikroorganisme, sifat-sifat spora, cara mendeteksi spora.

Sporulasi terjadi dalam kondisi yang tidak menguntungkan bagi bentuk vegetatif. Bakteri memiliki 3 jenis spora:

– ENDOSPORES (spora sejati) – terletak di dalam#, memiliki indeks bias yang tinggi.

– ARTOSPORES – tersusun sebagai respons terhadap fragmentasi vegetatif B!!

– CHLAMYDIOSPORES (mikrokista) – terbentuk akibat penebalan dinding # vegetatif dan akumulasi nutrisi cadangan.

Hanya sekelompok kecil eubacteria yang mampu melakukan sporulasi, dan di antara yang bersifat patogen bagi chickweed, hanya Clostridium dan Bacillus. Setiap # vegetatif membentuk 1 endospora. Spora TAHAN terhadap suhu, pengeringan, radiasi dan bahan kimia (termasuk etanol 70°). Dapat dilestarikan lama. Diduga spora dapat disimpan di tanah kering hingga 1000 tahun, namun nyatanya setelah 50 tahun, 90% spora kehilangan viabilitasnya.

Secara morfologis, spora mungkin bulat, lonjong, elips, ada pula yang dilengkapi dengan “tulang rusuk yang kaku”.

PROSES SPORULASI dimulai segera ketika terjadi defisiensi bahan bergizi dan berlangsung sekitar 8 jam, dan tidak diperlukan sumber daya atau energi eksternal. Merangsang - glukosa, P dan NH 4, menghambat - pepton, laktosa, NaCl, CaCl 2. LANGKAH-LANGKAH berikut disorot:

1) Tahap persiapan - pembelahan berhenti, akumulasi inklusi lipid dimulai.

2) Tahap forespore - membran elips muncul, mengelilingi bagian sitoplasma dengan kepadatan dan sifat tinctorial yang berubah.

3) Pembentukan cangkang

4) Tahap pematangan spora - spora menjadi padat dan semua pergerakan #-sporangium terhenti.

5) Pemusnahan induk #.

6) Dalam kondisi optimal, terjadi perkecambahan spora. Pertama, aktif menyerap air dan membengkak, respirasi meningkat, aktivitas enzim meningkat, AA dilepaskan - metabolisme diaktifkan (selama periode ini spora KEHILANGAN RESISTENSI TERMAL). Spora kemudian pecah dan muncul bentuk vegetatif.

Rekombinasi adalah serangkaian proses yang terkait dengan penggantian bagian asam nukleat asli dengan bagian yang homolog (serupa).

Dalam hal ini, derajat homologinya bisa berbeda: dari identitas lengkap rangkaian nukleotida asli dan baru hingga perbedaan nyata yang menyebabkan perubahan fenotipe. Hasil rekombinasi akan terbentuk kombinasi alel baru, contoh: AB + ab → Ab + aB.

Pada prokariota, ada tiga cara untuk memasukkan DNA asing ke dalam genom: transformasi, konjugasi, dan transduksi.

Transformasi

Transformasi adalah transfer DNA murni dari satu sel ke sel lainnya. Transformasi ini ditemukan oleh ahli bakteriologi F. Griffiths pada tahun 1928 dalam percobaan dengan pneumokokus. Pneumokokus memiliki dua jenis strain: bentuk S dan R.

Bentuk S dicirikan oleh adanya kapsul polisakarida, yang bila dibudidayakan secara artifisial, ia membentuk koloni halus dan berkilau; bentuk ini bersifat patogen bagi tikus. Bentuk R tidak memiliki kapsul, bila dibudidayakan secara artifisial membentuk koloni kasar; bentuk ini non-patogen untuk tikus. Namun jika sel S yang mati dan sel R hidup secara bersamaan disuntikkan ke tikus, maka tikus tersebut akan mati. Oleh karena itu, sifat genetik suatu strain mempengaruhi sifat genetik strain lainnya.

Pada tahun 1944, O. Avery, K. McLeod dan M. McCarthy membuktikan bahwa perubahan sifat herediter sel berhubungan dengan transfer DNA.

Kemampuan sel untuk bertransformasi dimungkinkan dalam kondisi khusus yang disebut kompetensi. Dalam sel kompeten, komposisi dinding sel dan plasmalemma berubah: dinding menjadi keropos, plasmalemma membentuk banyak invaginasi, dan antigen khusus muncul di permukaan luar - faktor kompetensi (khususnya, protein spesifik dengan berat molekul rendah).

DI DALAM kondisi alam DNA murni ekstraseluler terbentuk selama kematian (lisis) prokariota.

Biasanya, transformasi terjadi dalam satu spesies prokariota, namun dengan adanya gen homolog, transformasi antarspesies juga diamati.

Proses transformasi meliputi tahapan sebagai berikut:

1. Perlekatan transformasi DNA untai ganda ke reseptor pada permukaan sel penerima.

2. Konversi DNA untai ganda menjadi untai tunggal.

3. Penetrasi DNA untai tunggal ke dalam sel.

4. Integrasi transformasi DNA menjadi kromosom penerima dan rekombinasi materi genetik.

Panjang transformasi DNA harus antara 500 dan 200 ribu bp. Energi yang dilepaskan selama degradasi salah satu untai DNA digunakan untuk transpor aktif untai yang tersisa ke dalam sel.

Tiga tahap transformasi pertama tidak bergantung pada komposisi nukleotida DNA. Namun, proses integrasi transformasi DNA ke dalam kromosom penerima lebih mungkin terjadi jika DNA tersebut sangat homolog dengan DNA penerima.

Proses transformasi digambarkan dalam diagram. Setiap segmen garis lurus berhubungan dengan satu untai DNA. DNA yang bertransformasi ditandai dengan warna hitam, dan DNA sel penerima ditandai dengan warna abu-abu.

Pada tahap pertama, transformasi DNA menempel pada situs reseptor di permukaan sel penerima.

Pada tahap kedua, DNA untai ganda pada permukaan sel diubah menjadi DNA untai tunggal karena pembelahan salah satu untai oleh nuklease bakteri.

Pada tahap ketiga, sisa untai DNA diangkut melintasi membran ke dalam sitoplasma. Ini menggunakan energi yang dilepaskan selama degradasi rantai komplementer.

Selama replikasi kromosom bakteri, untai DNA yang bertransformasi melekat pada wilayah DNA homolog (komplementer sebagian) pada sel penerima. Dalam hal ini, karena kurangnya saling melengkapi, heteroduplex ("heterozigot molekuler") terbentuk - bagian DNA beruntai ganda di mana tidak semua pasangan nukleotida memiliki basa nitrogen yang dihubungkan oleh ikatan hidrogen. Sisa DNA bereplikasi secara normal.

Setelah replikasi DNA berakhir, sel penerima membelah untuk membentuk dua sel: sel yang mengalami transformasi sebagian dengan kromosom yang mencakup wilayah DNA heterodupleks, dan sel yang tidak mengalami transformasi. Selama replikasi DNA dalam sel yang mengalami transformasi sebagian, rantai komplementer diselesaikan pada kedua untai DNA. Satu untai mempertahankan urutan nukleotida asli, sementara untai lainnya berubah total. Setelah pembelahan sel yang mengalami transformasi sebagian, satu sel yang tidak mengalami transformasi dan satu sel yang mengalami transformasi sempurna terbentuk, di mana urutan nukleotida asli digantikan oleh urutan nukleotida dari DNA yang bertransformasi.

Jadi, selama transformasi, gen penerima digantikan dengan urutan nukleotida homolog. Semakin tinggi derajat homologinya, semakin sukses transformasinya.

Frekuensi transformasi pada prokariota bergantung pada sifat DNA yang bertransformasi, konsentrasinya, keadaan sel penerima, dan jenis bakteri. Frekuensi maksimum sel yang ditransformasikan tidak melebihi 1 per 100 sel.

Transformasi juga dikenal pada eukariota. Namun, tidak ada situs reseptor pada permukaan sel eukariotik, dan transformasi DNA dimasukkan secara artifisial ke dalam sel. Misalnya, DNA dimasukkan ke dalam telur hewan melalui mikroinjeksi langsung, dan ke dalam telur tumbuhan melalui mikroinjeksi ke dalam tabung serbuk sari. Metode biobalistik (biolistik) banyak digunakan, memungkinkan masuknya setiap fragmen DNA ke dalam kultur jaringan tanaman.

Konjugasi

Pada prokariota, konjugasi adalah kontak langsung antara dua sel dengan kualitas berbeda, disertai dengan setidaknya sebagian transfer materi genetik dari sel donor ke sel penerima. (Proses konjugasi ditemukan pada tahun 1946 oleh J. Lederberg dan E. Tatum).

Pada E. coli, sel donor (“jantan”) berbentuk lonjong, sel penerima (“betina”) berbentuk isodiametris. Sel donor membentuk vili seks (pili), yang menariknya ke sel penerima dan membentuk saluran sitoplasma. Melalui saluran ini, DNA berpindah dari sel donor ke sel penerima. Ada tiga jenis sel donor: F+ (ef-plus), Hfr (eh-ef-a) dan F′ (ef-prim).

F + -donor mengandung faktor jenis kelamin di sitoplasma - F-plasmid tertentu.

Plasmid F adalah replika otonom yang panjangnya sekitar 100 kb. Lebih dari 20 gen telah dipelajari dalam F-plasmid. Sekitar setengahnya membentuk tra operon raksasa (panjang sekitar 30 kb); produk operon ini mengontrol pembentukan kontak antara donor dan penerima dan transfer DNA yang sebenarnya. Gen yang tersisa mengatur fungsi tra operon.

Sel penerima tidak mengandung plasmid F dan ditetapkan sebagai sel F.

Ketika jembatan sitoplasma terbentuk, salah satu rantai F-plasmid dipotong pada titik tertentu (titik O), dan replikasi DNA dimulai pada rantai komplementer sesuai dengan prinsip “lingkaran berputar”. Salinan rantai komplementer melewati jembatan sitoplasma ke dalam sitoplasma sel penerima, dan rantai yang hilang diselesaikan di sana. Setelah replikasi selesai, DNA plasmid untai ganda menutup menjadi cincin, dan sel F – berubah menjadi sel F+. Waktu penuh Mentransfer salinan plasmid F ke sel penerima membutuhkan waktu kurang lebih 5 menit.

Namun bila disilangkan F + × F –, hanya gen yang terkandung di dalamnya F–plasmid; gen housekeeping yang terlokalisasi pada kromosom bakteri tidak ditransfer ke sel penerima.

Pada saat yang sama, F-plasmid dapat berintegrasi ke dalam kromosom bakteri, yaitu memasuki keadaan terintegrasi. Ada sekitar 20 situs integrasi F-plasmid dalam kromosom bakteri. Kemudian, ketika salinan salah satu rantai plasmid F ditransfer ke sel penerima, salinan salah satu rantai kromosom bakteri juga ikut dibawa. Sel dengan F-plasmid terintegrasi disebut donor Hfr (dari bahasa Inggris “rekombinasi frekuensi tinggi”). Tergantung pada kondisinya, transfer lengkap atau sebagian salinan kromosom bakteri Hfr donor ke sitoplasma penerima dapat dilakukan. Hasilnya, sebuah sel terbentuk dengan satu kromosom bakteri beruntai ganda asli dan satu molekul DNA beruntai tunggal homolog lengkap atau tidak lengkap. Sel seperti itu disebut merozigot (“zigot parsial”). Selanjutnya, selama replikasi DNA, terjadi rekombinasi. Proses ini pada dasarnya tidak berbeda dengan rekombinasi selama transformasi.

Pemindahan salinan DNA dimulai kira-kira dari tengah DNA plasmid F (dari titik O, di mana salah satu untai DNA dipotong dan replikasi DNA plasmid F dimulai). Jadi, separuh dari DNA plasmid F memasuki sel penerima pada awal konjugasi, dan separuh lainnya hanya setelah transfer lengkap salinan DNA kromosom. Dibutuhkan lebih dari 100 menit untuk menyelesaikan proses ini pada t = 37 0 C. Namun, dalam kondisi alami, konjugasi terganggu jauh lebih awal; hanya sebagian salinan kromosom donor dan hanya separuh pertama DNA F-plasmid yang masuk ke sel penerima. Dengan demikian, sel penerima tidak menerima sifat-sifat donor Hfr.

Namun, ada strain bakteri yang salinan kromosom bakterinya bersama dengan salinan DNA F-plasmid ditransfer sepenuhnya. Sel-sel seperti itu disebut donor vHfr (dari bahasa Inggris “frekuensi rekombinasi sangat tinggi”).

Kemungkinan transfer gen tertentu ke dalam sel penerima bergantung pada jaraknya dari DNA plasmid F, atau lebih tepatnya, dari titik O di mana replikasi DNA plasmid F dimulai. Semakin lama waktu konjugasi, semakin tinggi kemungkinan transfer suatu gen. Hal ini memungkinkan untuk membuat peta genetik bakteri dalam hitungan menit konjugasi. Misalnya, pada Escherichia coli, gen thr (operon dari tiga gen yang mengontrol biosintesis treonin) terletak di titik nol (yaitu, tepat di sebelah DNA F-plasmid), gen lac ditransfer setelah 8 menit, gen recE - setelah 30 menit, gen argR - setelah 70 menit, dll.

Plasmid F dapat bertransisi dari keadaan terintegrasi ke keadaan otonom melalui eksisi sendiri dari kromosom bakteri. Dalam hal ini, dimungkinkan untuk menangkap bagian DNA kromosom (hingga 50% gen kromosom). Plasmid F, yang mengandung gen kromosom, disebut faktor F′. Perpindahan materi genetik selama persilangan F ′ × F disebut seksduksi.

Selain F-plasmid, jenis faktor seks lainnya (R, Ent, Hly, Col) diketahui pada prokariota, memastikan transfer materi genetik dari bakteri ke bakteri. Berdasarkan plasmid alami (termasuk DNA kloroplas dan mitokondria), diperoleh molekul DNA semi sintetik yang menjamin perpindahan materi genetik dari satu sel ke sel lain, yang disebut vektor. Vektor harus memastikan tidak hanya transfer gen yang stabil, tetapi juga regulasi transkripsinya.

Plasmid prokariotik hanya dapat bereplikasi pada sel prokariotik. Pada saat yang sama, terdapat kebutuhan untuk mentransfer gen dari eukariota ke prokariota dan sebaliknya. Untuk tujuan ini, digunakan shuttle plasmid, yang mengandung dua replikator (prokariotik dan eukariotik) dan mampu bereplikasi pada sel prokariotik dan eukariotik, misalnya plasmid Ti dan Ri, yang mampu bereplikasi pada sel prokariotik dan eukariotik. sel tumbuhan, dan vektor semi-sintetis dibuat berdasarkan mereka. Untuk melindungi vektor dari kehancuran oleh nuklease, mereka dibungkus dalam vesikel fosfolipid - liposom.

Transduksi

Transduksi adalah perpindahan materi genetik menggunakan virus dari sel donor ke sel penerima. (Fenomena transduksi ditemukan pada tahun 1951 oleh N. Zinder (murid J. Lederberg)).

Selama transduksi, DNA dari sel inang memasuki virion. Virion menginfeksi sel lain, dan DNA sel bakteri asli memasuki sel bakteri lain. DNA virus berintegrasi ke dalam kromosom bakteri, dan DNA bakteri yang dimasukkan bergabung kembali dengan DNA kromosom bakteri. Hasilnya, 50% sel diubah.

Ada transduksi umum (nonspesifik), terbatas (spesifik) dan gagal.

Transduksi umum

Selama transduksi umum, fragmen DNA bakteri donor secara acak dimasukkan ke dalam partikel fag yang matang bersama dengan DNA fag atau sebagai pengganti DNA fag. Fragmen DNA bakteri terbentuk ketika dipotong oleh enzim yang dikendalikan fag. Partikel fag dapat mencakup hingga 100 gen bakteri.

Transduksi terbatas

Dengan transduksi terbatas, terjadi rekombinasi - DNA bakteri menggantikan bagian DNA fag. DNA rekombinan mengandung sejumlah kecil gen bakteri yang berdekatan dengan DNA fag yang terintegrasi ke dalam kromosom bakteri.

Secara umum dan transduksi terbatas, DNA donor menggantikan daerah homolog DNA penerima. Proses ini mirip dengan transformasi.

Transduksi yang gagal dapat bersifat nonspesifik dan spesifik. Esensinya terletak pada kenyataan bahwa fragmen DNA yang ditransduksi oleh fag tidak termasuk dalam kromosom penerima, tetapi ada sebagai replika sitoplasma. Cepat atau lambat replika ini akan hilang.

Fenomena transduksi oleh virus banyak digunakan dalam transfer gen pada eukariota. Jika virus yang digunakan tidak mampu membentuk kapsid (yaitu hanya ada dalam bentuk DNA), maka transduksi pada dasarnya tidak berbeda dengan transformasi atau transfer konjugatif materi genetik menggunakan vektor plasmid. Sistem vektor telah dibuat berdasarkan virus SV40 yang dimodifikasi (terbentuk hingga 100 ribu salinan dalam satu sel), herpes, vaccinia, dan virus mosaik kembang kol.

Perlu ditekankan sekali lagi bahwa semua jenis rekombinasi yang dijelaskan tidak terkait dengan penambahan bagian DNA baru, tetapi dengan penggantian urutan nukleotida yang ada. Semakin tinggi derajat homologi antara DNA transformasi dan DNA asli, semakin tinggi kemungkinan keberhasilan rekombinasi. Cara termudah untuk mencapai rekombinasi adalah enzim yang ditemukan di semua organisme. Lebih sulit untuk memperkenalkan regulator baru yang sangat spesifik ke dalam genom. Oleh karena itu, untuk memasukkan gen baru ke dalam genom, digunakan metode yang lebih kompleks yang terkait dengan modifikasi biokimia DNA.

Topik 7: Warisan sitoplasma . Genetika sel somatik dan kain.

1. Warisan sitoplasma. Materi genetik organel semi otonom. Warisan plastida. Warisan melalui mitokondria. Kemandulan pria sitoplasma

2. Jenis warisan khusus. Penentuan sitoplasma. Warisan melalui infeksi dan endosimbion

3. Genetika sel somatik. Mutasi somatik. Chimera. Genetika kanker.

infeksi pencernaan mikroba

Rekombinasi adalah proses pertukaran materi genetik dengan cara memecah dan menggabungkan molekul yang berbeda. Rekombinasi terjadi untuk memperbaiki kerusakan untai ganda pada DNA dan melanjutkan replikasi ketika garpu replikasi terhenti pada eukariota, bakteri, dan archaea. Virus dapat bergabung kembali antara molekul RNA genomnya.

Rekombinasi pada eukariota biasanya terjadi pada saat pindah silang pada proses meiosis, khususnya pada saat pembentukan sperma dan sel telur pada hewan. Rekombinasi, bersama dengan replikasi DNA, transkripsi RNA, dan translasi protein, adalah salah satu rekombinasi homolog awal yang mendasar.

Rekombinasi homolog

Klasifikasi jenis rekombinasi homolog: alel, ektopik dan homeolog; timbal balik (crossing over) dan non-timbal balik (konversi gen).

Rekombinasi timbal balik. Gagasan awal tentang sifat pindah silang: hipotesis “pecah dan gabung” dan “penyalinan selektif”. Eksperimen Meselson untuk membuktikan mekanisme “break and join”. Pengembangan pendekatan metodologis untuk mempelajari mekanisme rekombinasi molekuler. Dua tahap pembentukan DNA rekombinan: molekul rekombinan “bersama” dan primer.

Kontrol genetik dari rekombinasi homolog pada bakteriofag. Sistem Merah pada bakteriofag l. Eksonuklease l. sistem orf. Bakteriofag T4: peran gen 30, 32, 43, 46, 47, 49 dan uvsX. Enzimologi reaksi rekombinasi: endo dan eksonuklease, DNA polimerase, DNA ligase, protein UvsX, protein SSB dan protein lainnya. Proses “perpindahan untai”, pembentukan D-loop, “migrasi cabang”, koreksi heteroduplex. Tahapan utama pindah silang adalah: prasinapsis, sinapsis, dan pascasinapsis. Pola pindah silang pada bakteriofag. Kesamaan proses rekombinasi dan perbaikan DNA.

Model dasar rekombinasi homolog. Model liburan. Prasyarat model, esensi, makna. Pengembangan model pada penelitian selanjutnya, nya kondisi saat ini. Model Membaca Meselson. Model perbaikan DNA double-strand break (DSB) pada ragi (Zhostak et al.) sehubungan dengan pindah silang dan konversi.

Rekombinasi selama transformasi DNA kromosom pada bakteri. Parameter rekombinasi. Ukuran fragmen DNA donor terintegrasi. Kinetika dan efisiensi transformasi. Bukti integrasi fragmen DNA donor beruntai tunggal. Kontrol genetik dan tahapan utama proses transformasi pada Bacillus subtilis dan Streptococcus pneumoniae. Kompleks donor-penerima. Kontrol genetik dan mekanisme rekombinasi selama transformasi pada Haemophilus influenzae. Transformosom.

Rekombinasi selama konjugasi pada Escherichia coli. Ciri-ciri transfer DNA konjugatif. Mekanisme integrasi DNA donor ke dalam kromosom sel penerima.

Kontrol genetik dari rekombinasi homolog pada E. coli. Gen yang terlibat dalam prasinapsis: recA, recB, recC, recD, recE, recJ, dll. Efek pleiotropik dari mutasi recB dan recC. Nuklease RecBCD yang bergantung pada ATP, aktivitasnya, mekanisme kerja dan perannya dalam berbagai proses genetik. Situs Chi sebagai hotspot rekombinasi. Fleksibilitas nuklease yang bergantung pada ATP untuk bakteri. Gen yang mengontrol proses sinapsis: recA, recF, recO, recR, ssb, dll. Sifat mutan recA. Protein RecA, karakteristiknya. Reaksi yang dikatalisis oleh protein RecA, peran kuncinya dalam tahap pertama proses pindah silang: prasinapsis dan sinapsis. Sifat sinapsis selama rekombinasi homolog. Filamen DNA RecA, struktur dan fungsinya dalam rekombinasi. Skema pindah silang pada E. coli dengan partisipasi nuklease RecBCD dan protein RecA. Homolog RecA pada organisme prokariotik dan eukariotik lainnya. Peran protein SSB. Gen pascasinapsis: ruvA, ruvB, ruvC, recG dan produknya. Peran dalam migrasi hemichiasma Holliday dan penyelesaiannya.

Mutasi penekan sbcA, sbcB, sbcC dan sbcD. Eksonuklease I dan VIII. SbcCD nuklease. Tiga jalur rekombinasi DNA kromosom pada E. coli K-12 menurut Clark: RecBCD, RecF dan RecE, karakteristiknya. Peran jalur RecF dan RecE dalam rekombinasi homolog plasmid.

Ciri-ciri proses pindah silang pada eukariota. Persilangan meiosis. Peran kompleks sinaptonemal. Kontrol genetik rekombinasi meiosis. Keanekaragaman protein mirip RecA (rekombinasi) pada eukariota.

Persilangan mitosis: hubungan antara rekombinasi timbal balik dan non-timbal balik. Menyeberang di sel G1. Perbedaan kontrol genetik persilangan meiosis dan mitosis pada ragi Saccharomyces.

Hotspot rekombinasi pada eukariota. Peran DNA DNR dalam inisiasi persilangan meiosis dan mitosis.

Perbaikan rekombinasi DNR pada DNA kromosom dan plasmid dalam ragi. Kontrol genetik dan keragaman mekanisme: model Zhostak dkk dan modifikasinya, mekanisme “pemecahan dan penyalinan”, “anil untaian DNA komplementer” (“anil untai tunggal”), “ligasi yang bergantung pada homolog”.

Rekombinasi ektopik, kontrol genetiknya, mekanisme molekuler dan signifikansi biologis.

Konversi gen (koreksi heteroduplex rekombinasi). Non-timbal balik dari rekombinasi intragenik. Hipotesis koreksi dasar tidak berpasangan (Halliday). Kontrol genetik dan jalur koreksi untuk heteroduplex di E.coli. Sistem untuk perbaikan pangkalan yang tidak berpasangan dengan pembentukan dan konstruksi celah yang diperluas dalam heterodupleks. Sistem Mut HLSU, karakteristiknya. Model molekul koreksi heteroduplex yang melibatkan sistem MutHLSU. Konservasi evolusioner protein MutL dan MutS. Peran protein MutL dan MutS dalam proses koreksi basa tidak berpasangan dan dalam regulasi rekombinasi homeolog. Sistem untuk mengoreksi basa tidak berpasangan di E.coli dengan pembentukan dan konstruksi celah pendek. Koreksi heteroduplex selama transformasi bakteri, kontrol genetiknya (sistem Hex), pengaruhnya terhadap hasil pemetaan genetik. Koreksi dan interferensi negatif yang tinggi.

Konversi gen pada eukariota. Analisis tetrad persilangan interalel. Jenis buku catatan. Polaritas konversi, alasannya. Kokonversi. Panjang bagian konversi. Pertanyaan tentang hubungan antara konversi meiosis dan rekombinasi timbal balik dari penanda yang mengapit. Konversi gen alelik mitosis. Konversi meiosis dan mitosis ektopik. Pergantian lokus MAT dalam ragi homothallic. Kontrol genetik konversi gen pada ekariota menggunakan contoh ragi dan manusia. Homolog eukariotik dari protein bakteri MutL dan MutS - keluarga protein PMS, MHL, MHS, dll., fungsinya dalam rekombinasi dan proses seluler lainnya. Kompleksitas sistem koreksi ketidakcocokan pada eukariota, berdasarkan partisipasi beragam homolog protein bakteri MutL dan MutS.

Peran konversi dalam evolusi dan entogenesis. Hubungan antara proses pindah silang dan konversi pada berbagai sistem genetik. Proses konversi yang terjadi secara independen dari pindah silang.

Proses rekombinasi yang tidak memerlukan homologi untuk sinapsis

Rekombinasi spesifik lokasi. Distribusi sistem rekombinasi spesifik lokasi pada prokariota dan eukariota, fungsinya. Topoisomerase tipe I spesifik lokasi sebagai protein kunci rekombinasi spesifik lokasi pada bakteriofag, bakteri, dan ragi. Dua keluarga topoisomerase I spesifik lokasi adalah integrase dan resolvase.

Rekombinasi spesifik lokasi selama integrasi dan eksisi fag l. Skema Campbell. Perbedaan peta genetik fag vegetatif dan profag. Struktur situs attP dan attB. Sistem Int. Protein int sebagai perwakilan dari keluarga integrase. Protein IHF E.coli. Intasoma. Model molekul integrasi dan eksisi fag l. Penjajaran antiparalel dari situs att selama sinapsis. Sifat sinapsis selama rekombinasi spesifik lokasi.

Inversi DNA spesifik lokasi pada bakteriofag dan bakteri (sistem Din) dan ragi. Protein rekombinasi utama adalah invertase sebagai perwakilan dari keluarga resolvase. Peningkat rekombinasi untuk inversi spesifik lokasi. Protein E.coli Fis. Invertasoma. Model rekombinasi molekuler dilakukan dengan resolusi. Peran inversi spesifik lokasi dalam regulasi ekspresi gen.

Transposisi elemen genetik bergerak. Transposisi pada prokariota. Elemen genetik seluler: elemen IS, transposon (Tn), Mu phage. Struktur elemen bergerak. Fungsi dikendalikan oleh berbagai elemen bergerak. Transposase. Partisipasi protein sel inang dalam transposisi. Pertanyaan tentang kekhususan integrasi elemen bergerak ke dalam DNA target. Kesamaan reaksi yang membentuk proses transposisi di jenis yang berbeda elemen bergerak prokariota dan eukariota.

Organisasi genetik transposon sederhana dari keluarga Tn3. Gen tnpA dan tnpR, produknya. Transposisi replikasi, dua tahap proses. Model molekuler Shapiro. Kontrol genetik dan mekanisme molekuler transposisi non-replikasi pada transposon kompleks Tn5, Tn9 dan Tn10. Kontrol genetik dan mekanisme transposisi pada fag Mu. Transpososom.

Transposon konjugatif bakteri gram positif dan gram negatif, klasifikasinya. Kontrol genetik dan mekanisme transposisi. Signifikansi biologis.

Elemen genetik seluler eukariota (ragi, tumbuhan, Drosophila, mamalia). Klasifikasi unsur bergerak eukariotik. Unsur dengan struktur tipe prokariotik. Retrotransposon tipe I pada ragi, tumbuhan dan hewan, strukturnya, kontrol genetik dan mekanisme transposisi, klasifikasi. Retrotransposon tipe II: fitur struktural, distribusi, mekanisme transposisi.

Efek genetik yang disebabkan oleh unsur transposable pada prokariota dan eukariota: perubahan ekspresi gen, mutasi gen, penataan ulang kromosom, disgenesis hibrid. Partisipasi elemen bergerak dalam organisasi struktur kromosom. Berperan dalam entogenesis organisme hidup dan dalam evolusi materi genetik. Elemen seluler sebagai alat penelitian genetika.

Rekombinasi ilegal. Kisaran fenomena yang disebabkan oleh rekombinasi ilegal. Rekombinasi nonhomolog pada bakteri yang dikatalisis oleh DNA girase. Model molekul (Ikeda). Rekombinasi nonhomolog yang melibatkan protein kinase yang bergantung pada DNA pada vertebrata. Berperan dalam perbaikan kerusakan untai ganda, integrasi DNA eksogen ke dalam kromosom dan penataan ulang rangkaian DNA imunoglobulin.

Penataan ulang rekombinasi terprogram materi genetik dalam entogenesis

Penggabungan bagian gen yang terputus menggunakan rekombinasi spesifik lokasi selama sporulasi pada Bacillus subtilis dan selama pembentukan heterokista pada cyanobacteria berfilamen. Penataan ulang materi genetik selama pembentukan makronukleus pada ciliate bersilia. Pengurangan kromatin di sejumlah perwakilan invertebrata.

Rekombinasi spesifik lokasi pada vertebrata yang terlibat dalam penataan ulang rangkaian DNA imunoglobulin. Struktur molekul imunoglobulin. Organisasi dan struktur urutan DNA yang terlibat dalam pembentukan gen yang mengkode imunoglobulin. Peran produk gen RAG1 dan RAG2. Mekanisme rekombinasi spesifik lokasi selama penggabungan segmen pengkodean gen imunoglobulin. Partisipasi proses genetik lain dalam pembentukan gen imunoglobulin: rekombinasi homolog (persilangan mitosis ektopik, konversi mitosis ektopik), rekombinasi ilegal, hipermutagenesis, penyambungan alternatif. Hubungan proses ini dengan tahap diferensiasi limfosit B tertentu.

Transformasi adalah proses penyerapan oleh suatu sel suatu organisme atas molekul DNA bebas dari lingkungan dan integrasinya ke dalam genom, yang mengarah pada munculnya sifat-sifat baru yang dapat diwariskan dalam sel tersebut, yang merupakan ciri-ciri organisme donor DNA. Terkadang transformasi dipahami sebagai segala proses transfer gen horizontal, termasuk transduksi, konjugasi, dll.

Transformasi prokariota

Dalam suatu populasi, hanya sebagian bakteri yang mampu menyerap molekul DNA dari lingkungan. Keadaan sel yang memungkinkan hal ini disebut keadaan kompetensi. Biasanya, jumlah maksimum sel kompeten diamati pada akhir fase pertumbuhan logaritmik.

Dalam keadaan kompeten, bakteri menghasilkan protein khusus dengan berat molekul rendah (faktor kompetensi) yang mengaktifkan sintesis autolisin, endonuklease I, dan protein pengikat DNA. Autolysin menghancurkan sebagian dinding sel, yang memungkinkan DNA melewatinya, dan juga mengurangi resistensi bakteri terhadap guncangan osmotik. Dalam keadaan kompeten, tingkat metabolisme secara keseluruhan juga menurun. Dimungkinkan untuk secara artifisial membawa sel ke dalam kondisi kompeten. Untuk tujuan ini, media dengan konten tinggi ion kalsium, cesium, rubidium, elektroporasi, atau mengganti sel penerima dengan protoplas tanpa dinding sel.

Efisiensi transformasi ditentukan oleh jumlah koloni yang tumbuh pada cawan Petri setelah menambahkan 1 g DNA plasmid superkoil ke dalam sel dan menyemai sel pada media nutrisi. Metode modern memungkinkan pencapaian efisiensi 106--109.

DNA yang diserap harus beruntai ganda (efisiensi transformasi DNA beruntai tunggal jauh lebih rendah, tetapi sedikit meningkat dalam lingkungan asam), panjangnya harus minimal 450 pasangan basa. PH optimal untuk proses ini adalah sekitar 7. Untuk beberapa bakteri (Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus), DNA yang diserap harus mengandung urutan tertentu.

DNA teradsorpsi secara ireversibel pada protein pengikat DNA, setelah itu salah satu untai dipotong oleh endonuklease menjadi fragmen sepanjang 2-4 ribu pasangan basa dan menembus sel, yang kedua hancur total. Jika fragmen-fragmen ini memiliki tingkat homologi yang tinggi dengan bagian mana pun dari kromosom bakteri, maka bagian tersebut dapat diganti dengan bagian tersebut. Oleh karena itu, efisiensi transformasi bergantung pada jarak evolusioner antara donor dan penerima. Total waktu proses tidak melebihi beberapa menit. Selanjutnya bila dibagi menjadi satu sel anak perempuan DNA yang dibangun berdasarkan untai DNA asli memasuki untai lain - berdasarkan untai dengan fragmen asing yang disertakan (pembelahan)

Transformasi sel eukariotik menggunakan kation polimer sintetik

Pengiriman asam nukleat asing ke dalam sel utuh, atau transformasi mendasari banyak metode rekayasa genetika. Pengangkutan gen fungsional ke dalam jaringan dapat dilakukan kemungkinan koreksi defisiensi dan mutasi gen, yang mengakibatkan patologi keturunan yang parah atau tumor kanker. Saat ini, sejumlah teknik telah dikembangkan untuk memasukkan DNA ke dalam sel, di antaranya yang paling umum adalah pengendapan dengan kalsium fosfat atau dietilaminoetil-dekstran (DEAE-dekstran), elektroporasi, mikroinjeksi, penyisipan DNA ke dalam cangkang virus atau liposom yang direkonstruksi ( vesikel lipid membran buatan).

Terlepas dari keragaman metode ini, pencarian cara baru untuk mengubah sel pro dan eukariotik terus berlanjut. Di satu sisi, hal ini disebabkan oleh kebutuhan untuk meningkatkan efisiensi transformasi; di sisi lain, metode yang tercantum di atas hanya berlaku untuk sejumlah garis sel terbatas dan tidak efektif ketika mencoba memasukkan RNA ke dalam sel. Terakhir, sebagian besar pendekatan ini tidak dapat digunakan untuk transformasi genetik in vivo.

Vektor retroviral, vektor berdasarkan virus yang mengandung DNA dan HIV, liposom berdasarkan lipid kationik, dan kation pengikat DNA polimer digunakan sebagai pembawa DNA. Penggunaan polimer sintetik sebagai pembawa DNA memiliki sejumlah keuntungan: kemudahan penyimpanan dan pemurnian, kemudahan pengujian toksisitas dan keamanan dan, yang sangat penting untuk terapi gen, mengurangi risiko komplikasi patogenetik dan imunologis.

Ketika larutan polikation linier dan DNA dicampur, kompleks interpolielektrolit (IPEC) terbentuk karena pembentukan sistem kooperatif ikatan elektrostatik antar rantai. Dalam hal ini, rantai polikationik mengelilingi molekul DNA, membentuk bola atau toroid, bergantung pada jenis polimernya. Dimasukkannya ke dalam IPEC menyebabkan pemadatan DNA, meningkatkan ketahanannya terhadap aksi nuklease, meningkatkan interaksinya dengan membran sel dan meningkatkan aktivitas transformasi dalam kaitannya dengan sel prokariotik dan eukariotik. Dengan menggabungkan molekul polikation dengan ligan yang mampu berikatan spesifik dengan membran sel, dimungkinkan untuk memastikan penetrasi IPEC ke dalam sel melalui jalur reseptor, dan pengiriman yang ditargetkan ke dalam tubuh ke sel target.

Sistem pengiriman DNA untuk digunakan dalam terapi gen harus memastikan penetrasi DNA ke dalam organ, jaringan, atau kelompok sel tertentu yang diinginkan, dan kemudian ke dalam inti sel. Oligonukleotida antisense, yang paling sering digunakan dalam terapi gen, harus menemukan mRNA atau wilayah DNA kromosom yang menjadi sasarannya. Gen yang diperkenalkan harus menjadi bagian dari suatu konstruksi yang mampu mengekspresikannya.

Namun, ini merupakan masalah yang cukup rumit. Ketika asam nukleat atau oligonukleotida dimasukkan ke dalam tubuh, ia tidak akan mencapai jaringan yang diinginkan atau kepada otoritas yang tepat, dan bagian dari mereka yang akan masuk di tempat yang benar, hanya sebagian kecil yang mampu melewati membran sel hidrofobik. Selain itu, selama evolusi, mekanisme dikembangkan untuk melindungi sel-sel tubuh dari faktor penyerang. lingkungan luar, termasuk DNA asing. Begitu berada di dalam sel, DNA asing mungkin tidak terlokalisasi di tempat yang diperlukan dan, terlebih lagi, mungkin berakhir di lisosom, di mana DNA tersebut akan dihancurkan oleh nuklease.

Penetrasi ke dalam sel dan transportasi intraseluler IPEC terjadi, mungkin karena pembentukan dan penghancuran endosom secara berurutan. Pada setiap tahapan proses ini, sebagian besar material hilang. Sedikitnya pelepasan vektor dari endosom ke dalam sitoplasma dan transportasinya yang tidak efektif ke dalam nukleus menyebabkan rendahnya efisiensi ekspresi transgen.

Peta pembatasan plasmid pBR 322:

angka menunjukkan penomoran nukleotida;

garis tipis - situs tunggal yang dikenali oleh enzim restriksi;

panah abu-abu tebal di atas - arah transkripsi;

Pbla - Promotor gen Ampr - resistensi terhadap ampisilin;

Ptet - Promotor gen Tetr - resistensi tetrasiklin;

TT1 - Terminator transkripsi Rho-independen (posisi 3140-3160); TT2 - posisi 3080-3110; ROP adalah protein yang mendorong pembentukan dupleks antara RNA 1 dan RNA 2 (pengatur nomor salinan negatif); RNA 1 - mengontrol RNA (mengontrol jumlah salinan plasmid); RNA 2 - RNA “primer” (berfungsi sebagai primer untuk replikasi); panah hitam tebal - arah transkripsi RNA 1 dan RNA 2

Vektor berdasarkan fag M13

Ada tiga cara untuk meningkatkan efisiensi transfer DNA ke dalam sel eukariotik menggunakan polikation sintetik. Pertama, ini meningkatkan spesifisitas transfeksi karena ligan bergabung dengan molekul polikation dan memastikan interaksi selektif kompleks dengan sel dengan fenotipe tertentu. Kedua, peningkatan efisiensi transformasi melalui seleksi gen atau oligonukleotida yang dimasukkan ke dalam sel. Ketiga, peningkatan frekuensi transfeksi, yang dicapai melalui penggunaan ligan yang berinteraksi lebih efektif dengan membran sel, dan zat yang mengganggu kestabilan membran. Selain itu, sintesis polikation baru juga dimungkinkan.

Laboratorium Virologi Molekuler dan Rekayasa Genetika dari Institut Penelitian Influenza dari Akademi Ilmu Kedokteran Rusia di St. Petersburg sedang mempelajari cara mengirimkan DNA dan partikel virus ke dalam sel. Karya ini menggunakan seperangkat pendukung polimer yang disintesis oleh karyawan Institut Senyawa Makromolekul dari Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia. Plasmid berikut digunakan sebagai vektor ekspresi: pUC 18, mengandung promotor sitomegalovirus dan gen b-galaktosidase, dan pBR 322, berisi promotor sitomegalovirus dan gen protein fluoresen hijau alga.

Dari hasil penelitian, ditemukan bahwa IPEC dari poli-(2-(dimetilamino)etil) metakrilat (PDMAEMA) dengan berat molekul rendah memiliki aktivitas transfeksi terbesar. Penelitian lebih lanjut akan memungkinkan kita mengembangkan pendekatan baru untuk memecahkan masalah ini masalah saat ini dalam virologi, molekuler dan sel biologi, rekayasa genetika, terapi gen.

Transduksi (dari bahasa Latin transductio - pergerakan) adalah proses pemindahan DNA bakteri dari satu sel ke sel lain oleh bakteriofag. Transduksi umum digunakan dalam genetika bakteri untuk pemetaan genom dan rekayasa strain. Baik fag beriklim sedang maupun fag virulen mampu melakukan transduksi; namun fag virulen menghancurkan populasi bakteri, sehingga transduksi dengan bantuan mereka tidak terlalu penting baik di alam maupun dalam penelitian.

Transduksi umum (nonspesifik).

Hal ini dilakukan oleh fag P1, yang ada dalam sel bakteri dalam bentuk plasmid, dan oleh fag P22 dan Mu, yang berintegrasi ke dalam bagian mana pun dari kromosom bakteri. Setelah induksi profag, dengan probabilitas 10?5 per sel, kesalahan pengemasan fragmen DNA bakteri ke dalam kapsid fag mungkin terjadi, dalam hal ini, tidak ada DNA fag di dalamnya. Panjang fragmen ini sama dengan panjang DNA fag normal, asal usulnya bisa apa saja: bagian acak dari kromosom, plasmid, fag beriklim lainnya.

Begitu berada di sel bakteri lain, sebuah fragmen DNA dapat dimasukkan ke dalam genomnya, biasanya melalui rekombinasi homolog. Plasmid yang ditransfer oleh fag dapat menutup menjadi sebuah cincin dan bereplikasi di dalamnya kandang baru. Dalam beberapa kasus, sebuah fragmen DNA tidak diintegrasikan ke dalam kromosom penerima dan tidak direplikasi, tetapi disimpan di dalam sel dan ditranskripsi. Fenomena ini disebut transduksi gagal.

Transduksi tertentu

Transduksi spesifik paling baik dipelajari dengan menggunakan contoh fag L. Fag ini diintegrasikan hanya ke dalam satu wilayah (situs att) kromosom E. coli dengan urutan nukleotida tertentu (homolog dengan situs att dalam DNA fag). Selama induksi, eksklusi mungkin terjadi dengan kesalahan (probabilitas 10?3--10?5 per sel): sebuah fragmen dengan ukuran yang sama dengan DNA fag dipotong, tetapi dengan permulaan di tempat yang salah. Dalam kasus ini, beberapa gen fag hilang, dan beberapa gen E. coli ditangkap olehnya. Kemungkinan transfer gen dalam kasus ini menurun dengan bertambahnya jarak dari lokasi ke lokasi serangan.

Setiap fag beriklim sedang yang secara khusus diintegrasikan ke dalam kromosom dicirikan oleh lokasi attnya sendiri dan, oleh karena itu, gen-gen yang terletak di sebelahnya yang mampu ditransmisikan. Sejumlah fag dapat berintegrasi ke tempat mana pun pada kromosom dan mentransfer gen apa pun melalui mekanisme transduksi tertentu. Selain itu, kromosom biasanya mengandung urutan yang sebagian homolog dengan wilayah att DNA fag. Jika situs att yang benar-benar homolog rusak, fag dapat dimasukkan ke dalam kromosom sepanjang urutan ini dan transfer gen yang berdekatan dengannya selama transduksi spesifik dapat dicapai.

Ketika fag beriklim sedang yang membawa gen bakteri diintegrasikan ke dalam kromosom bakteri inang baru, fag tersebut sudah mengandung dua gen identik - gennya sendiri dan gen yang dibawa dari luar. Karena fag tidak memiliki sebagian gennya sendiri, fag seringkali tidak dapat diinduksi dan direproduksi. Namun, ketika sel yang sama terinfeksi dengan fag “penolong” dari spesies yang sama, induksi fag yang rusak menjadi mungkin. Baik DNA fag “penolong” yang normal maupun DNA fag yang rusak muncul dari kromosom dan bereplikasi, bersama dengan gen bakteri yang dibawanya. Oleh karena itu, sekitar 50% partikel fag yang dihasilkan membawa DNA bakteri. Fenomena ini disebut transduksi frekuensi tinggi(HFT dari transduksi frekuensi tinggi bahasa Inggris).

Konjugasi (dari bahasa Latin conjugatio - koneksi), proses paraseksual - transfer searah sebagian materi genetik (plasmid, kromosom bakteri) dengan kontak langsung antara dua sel bakteri. Ditemukan pada tahun 1946 oleh J. Lederberg dan E. Taitem. Hal ini sangat penting di alam karena mendorong pertukaran tanda-tanda yang berguna dengan tidak adanya hubungan seksual yang sebenarnya. Dari semua proses transfer gen horizontal, konjugasi memungkinkan terjadinya transfer jumlah terbesar informasi genetik.

Mekanisme

Agar berhasil menjalin kontak antara dua sel, plasmid konjugatif (jenis kelamin, menular) harus ada dalam sel donor. Yang pertama adalah penemuan F-plasmid: sebuah episome (yang mampu berintegrasi ke dalam kromosom bakteri), panjangnya sekitar 100 ribu pasangan basa. Plasmid membawa gen yang mengkode sejumlah fungsi. Salah satunya adalah pembentukan pili seks yang bertugas melakukan adhesi pada sel penerima.

Plasmid konjugatif juga mengkode protein yang mencegah menempelnya pili bakteri lain ke dinding sel bakteri tertentu. Oleh karena itu, sel-sel yang sudah mengandung plasmid yang dapat ditularkan memiliki kemungkinan beberapa kali lipat lebih kecil untuk bertindak sebagai penerima konjugasi.

Plasmid mengkode endonuklease yang memotong salah satu untai DNA-nya pada titik tertentu (oriT). Kemudian untai yang dipotong tersebut terlepas dan ujung 5" dipindahkan ke dalam sel penerima. Telah diduga bahwa DNA ditransfer melalui saluran di pili seks, namun kini telah ditunjukkan bahwa transfer terjadi melalui pori-pori di dinding sel. Di dalam segmen benang pertama yang memasuki sel penerima Gen anti-restriksi terletak di dalam DNA. Gen-gen ini harus ditranskripsi pada penerima segera setelah tiba di sana untuk memastikan akumulasi protein yang menghalangi proses penghancuran DNA oleh enzim restriksi. Akhirnya, rantai yang ditransfer ditutup menjadi sebuah cincin dan berdasarkan itu struktur untai ganda DNA plasmid dipulihkan.Keseluruhan proses memakan waktu beberapa menit.

Plasmid konjugatif dapat diintegrasikan ke dalam kromosom melalui rekombinasi homolog yang melibatkan elemen IS. Konjugasi mengikuti mekanisme yang sama, tetapi tidak hanya plasmid yang ditransfer ke penerima, tetapi juga materi kromosom donor. Dalam hal ini, prosesnya memakan waktu berjam-jam, dan untai DNA yang ditransmisikan sering kali putus. Dengan menghentikan transfer DNA secara artifisial ke waktu yang berbeda dan mengamati gen mana yang ditransfer, diperoleh peta kromosom E. coli dan ditampilkan struktur cincinnya.

Ketika dibelah dari suatu kromosom, plasmid dapat menangkap fragmennya dan memindahkannya ke sel lain (analogi dengan transduksi). Proses ini disebut seksduksi.

Beberapa plasmid kecil, yang disebut plasmid yang dapat dimobilisasi, dapat ditransfer selama konjugasi menggunakan alat transfer plasmid yang dapat ditransmisikan “pembantu”. Untuk melakukan ini, mereka harus mengandung urutan yang mirip dengan oriT plasmid konjugatif dan dikenali oleh endonukleasenya.

Transformasi - perubahan sifat herediter sel sebagai akibat dari penetrasi atau pengenalan buatan DNA asing ke dalamnya. Sifat faktor transformasi ditetapkan oleh Avery dan McLeod pada tahun 1944. Hanya bakteri yang dapat ditransformasikan ke dalam sel yang dapat ditembus oleh DNA untai ganda (utuh) dengan berat molekul tinggi. Kemampuan menyerap DNA merupakan suatu kompetensi dan bergantung pada keadaan fisiologis sel. DNA dapat diserap selama fase singkat tertentu dari perubahan permukaan sel. Dengan bantuan DNA, karakteristik seperti pembentukan kapsul, sintesis zat, aktivitas enzimatik, resistensi terhadap racun, antibiotik dapat ditularkan.DNA apa pun dapat menembus ke dalam sel yang kompeten, tetapi rekombinasi hanya terjadi dengan DNA dari spesies terkait. Konjugasi - Perpindahan materi genetik melalui kontak langsung antara 2 sel. Diteliti oleh Lederberg dan Tatum pada tahun 1946 tentang mutan E.coli. Satu mutan ditemukan pada asam amino A dan B, tetapi mampu mensintesis C&D, mutan kedua kompeten untuk itu (A-B-C+D+). Mutan-mutan ini tidak tumbuh atau membentuk koloni pada media nutrisi minimal, tetapi jika suspensi kedua mutan ditambahkan ke dalamnya, koloni akan muncul. Sel-sel koloni ini memiliki kemampuan turun-temurun untuk mensintesis semua asam amino (A+B+C+D+).Di sini, konjugasi berfungsi sebagai prasyarat untuk rekombinasi. Ketika mempelajari bakteri, ditemukan bahwa kemampuan suatu sel untuk menjadi donor dikaitkan dengan adanya faktor F (sel F+ yang tidak mengandung faktor – F- dan dapat berfungsi sebagai penerima) – plasmid, berbentuk lingkaran , molekul DNA beruntai ganda. Itu. Sel penerima menjadi donor melalui konjugasi, namun karakteristik kromosom tidak ditransfer. F-plasmid menyebabkan pembentukan sex fimbriae/F-pili pada sel, yang berfungsi untuk pengenalan saat kontak antara sel donor dan sel penerima dan memungkinkan pembentukan jembatan yang melaluinya DNA masuk ke dalam sel. Konjugasi biasa terjadi pada enterobakteri dan prokariota. Transduksi - transfer pasif gen bakteri dari satu sel ke sel lain oleh partikel bakteriofag, yang menyebabkan perubahan sifat herediter sel. Ada 2 jenis transduksi: a) Nonspesifik - di mana setiap fragmen DNA inang dapat ditransfer (DNA sel inang termasuk dalam partikel fag / ke gennya sendiri / sebagai gantinya); b) Spesifik - fragmen DNA yang ditentukan secara ketat dapat ditransfer; beberapa gen fag digantikan oleh gen inang). Dalam kedua kasus tersebut, fagnya rusak, mis. kehilangan kemampuan untuk melisiskan sel.

38. Faktor resistensi (faktor r). Sifat-sifat plasmid. Transposon.

1. Perlawanan– organisme yang resisten terhadap antigen apa pun. Bakteri yang resisten terhadap beberapa antibiotik telah ditemukan. Pada tahun 50an di Jepang (penyebab penyakit disentri. Banyak sekali infeksi bakteri dan hal ini dapat menular ke bakteri lain. Faktor R mengandung gen yang membuat sel kebal terhadap antibiotik tertentu. Beberapa faktor R menyebabkan resistensi langsung terhadap 8 antibiotik. , dan fag R lainnya memberikan resistensi terhadap logam berat (merkuri, nikel, kadmium) Plasmid R membawa 2 kelompok gen: 1) gen yang bertanggung jawab untuk transfer plasmid melalui konjugasi (gen tra ) dan mereka sangat- disebut “faktor transfer resistensi (RTF), 2) gen yang menentukan resistensi sebenarnya dan komposisinya. Hanya terdiri dari sebagian kecil plasmid.

RTF mencakup semua gen yang bertanggung jawab atas transfer faktor R dari sel ke sel, yang dilakukan melalui konjugasi. Artinya, faktor R, seperti faktor F, bersifat menular. Dimungkinkan untuk mentransfer faktor R antara beberapa genera bakteri yang berbeda, yang berkontribusi pada distribusi lebih lanjut. Modifikasi kimia fermitatif pada antibiotik adalah alasan utama terjadinya resistensi terhadap antibiotik tersebut akibat plasmid. Misalnya, kanamisin dan neomisin mengalami fosforilasi, dan pinpicin diinaktivasi oleh penisilinase. pos. Persediaan Karena faktor R, rekombinasi genetik dimungkinkan, maka dapat timbul kombinasi gen baru yang akan memberikan sifat tambahan pada mulut. Faktor R sangat penting untuk kemoterapi.

2. Bakteriosin. Banyak protein bact.sintetik, Yukotor. Membunuh spesies atau strain terkait atau menghambat pertumbuhannya. Protein ini disebut bakteriosin. Mereka adalah seorang pembuat kode. Plasmid khusus yang disebut faktor bakteriosinogenik. Bakteriosin telah diasingkan dari Escherichia coli (colicins) dan bakteria lain. Nama bakteriosin diberikan berdasarkan bentuk produksi bakteri tersebut, misalnya stafilokokus yang menghasilkan stafilokin. zat anorganik yang membunuh bakteri, disebut antiseptik.

3. Pengakuan lain, ditentukan oleh plasmid. Plasmid mungkin mengandung gen yang memberikan sejumlah sifat biologis spesifik yang, dalam kondisi tertentu, menciptakan keunggulan selektif. Gen enzim yang diperlukan untuk pemecahan campyphora, asam salisilat, dan substrat penting lainnya dapat ditemukan di plasmid. Daftar sifat yang diwarisi dari plasmid meliputi: fiksasi nitrogen, pembentukan bintil, penyerapan gula, sintesis hidrogenase, dll. Beberapa sifat ini dapat ditentukan oleh gen bakteri. Kromosom (pertukaran gen antara kromosom dan plasmid). Plasmid memainkan peran penting dalam evolusi prokariota.

4. Ketidakcocokan. Banyak bakteri mengandung plasmid dengan ukuran berbeda. Koeksistensi plasmid yang berbeda dalam satu sel menunjukkan bahwa plasmid tersebut kompatibel satu sama lain. Namun dua plasmid yang berkerabat tidak dapat hidup berdampingan dalam satu sel; keduanya tidak kompatibel. Semua plasmid termasuk dalam kelompok inkonsistensi yang sama: plasmid termasuk dalam kelompok inkonsistensi yang sama.

Transposon – Ini adalah rangkaian DNA yang dapat diintegrasikan ke dalam banyak bagian genom dan dapat “diangkut” dari plasmid ke kromosom bakteri atau ke plasmid lain. Transpason mengandung gen yang menentukan ciri-ciri luar yaitu resistensi terhadap antibiotik seperti pinicone, tetrasiklin, dll. Oleh karena itu lebih mudah dideteksi dibandingkan IS - El-ty (DNA asing, representatif .adalah penyisipan.setelah pertemuan pada bakteri kromosom dan plasmid.). Pada kedua sisi gen mulut yang terletak di dalam transposon, letaknya 2 sama secara berurutan, bisa searah atau berlawanan. Urutan basa DNA yang berulang ini sebagian identik dengan IS - Els.

41. Evolusi m/oov.

Sel-sel semua makhluk hidup, dari bentuk primitif hingga yang sangat terorganisir, terdiri dari elemen struktural yang sama dan menggunakan mekanisme yang sama untuk memperoleh energi dan pertumbuhan. Ini adalah kesatuan biokimia dari semua organisme hidup. Dalam proses evolusi terjadi pembentukan dan pembentukan berbagai bentuk makhluk hidup. Untuk proses evolusi kehidupan, perlu dibayangkan kondisi apa yang ada di Bumi yang memungkinkan terjadinya kehidupan secara spontan. Pada periode setelah pembentukan Bumi, terjadi proses biologis aktif di atasnya, yang mengubah penampilannya dan mengarah pada pembentukan kerak bumi, hidrosfer, dan atmosfer. Ketika zat organik di Bumi terakumulasi dalam jumlah besar => muncul kondisi di mana transisi dari evolusi kimia ke munculnya makhluk hidup pertama yang dapat bereproduksi sendiri dapat terjadi. Merupakan ciri khas sel-sel kehidupan yang selalu muncul dalam bentuk struktur tertentu yang terisolasi secara spasial dari lingkungan luar, tetapi terus-menerus berinteraksi dengannya sesuai dengan jenis sistem terbuka. Diasumsikan bahwa tahap evolusi selanjutnya dalam perjalanan menuju munculnya kehidupan adalah pembentukan organisasi struktural tertentu - senyawa organik yang disintesis secara abiogenik. Bentuknya bulat, diameter 0,5-7 mikron, menyerupai bakteri berbentuk kokoid, mengandung proteinoid, dan memiliki kestabilan tertentu. Pewarnaan Gram menunjukkan bahwa mikrosfer yang terbentuk dari proteinoid asam adalah gr-, dan mikrosfer yang terbentuk dari proteinoid basa adalah gr+. Tahap ini merupakan tahap transisi dari evolusi kimia ke biologi dan pola yang muncul dapat didefinisikan sebagai seleksi alam prebiologis. Selanjutnya diasumsikan bahwa prokariota pertama mungkin muncul di reservoir yang banyak mengandung zat organik.Ada organisme yang ada karena fermentasi dan memiliki fungsi utama metabolisme anaerobik. Jika kita berasumsi bahwa terdapat sulfat di reservoir pada saat itu, maka tahap evolusi selanjutnya adalah transpor elektron yang efektif dengan terciptanya potensi proton sebagai sumber energi untuk regenerasi ATP. Selain itu, secara eksperimental ditunjukkan bahwa pada tahap awal evolusi, prokariota dapat bereproduksi dan mengirimkan informasi kepada keturunannya tanpa partisipasi asam nukleat. Untuk evolusi prokariota lebih lanjut, perlu dibuat peralatan khusus yang akan memastikan reproduksi polipeptida yang akurat. Hal ini menyebabkan terbentuknya mekanisme sintesis baru - sintesis templat, yang didasarkan pada penggunaan sifat-sifat polinukleotida. Sifat molekul polinukleat adalah kemampuannya untuk bereproduksi secara akurat, berdasarkan prinsip saling melengkapi struktural.

Peristiwa utama dalam evolusi: peralihan dari atmosfer pereduksi primer ke atmosfer yang mengandung oksigen. Bakteri telah mengembangkan jenis metabolisme baru - respirasi aerobik, yang menjadi mungkin karena transformasi sitokrom menjadi oksidase terminal, menggunakan molekul O2 sebagai akseptor elektron. Diasumsikan bahwa 2 miliar tahun yang lalu semua prokariota fototrofik sudah ada, dan masih ada hingga saat ini. Prokariota awalnya menempati banyak relung ekologi yang berbeda, yang kemudian secara bertahap digantikan oleh eukariota. Perkembangan berbagai jenis metabolisme pada prokariota disebabkan oleh struktur sel yang sederhana, sistem pengaturan yang sangat berkembang, pertumbuhan yang cepat, dan adanya beberapa mekanisme transfer gen.

42.MIKROORG DAN IMUNITAS PATOGEN.

Imunitas melindungi kita dari agen infeksi: bakteri, virus, dan protozoa, yaitu melindungi tubuh dari segala benda asing.

Infeksi adalah proses biologis kompleks yang terjadi sebagai akibat penetrasi mikroba patogen ke dalam tubuh dan terganggunya keteguhan lingkungan internalnya.

Patogenisitas adalah kemampuan suatu jenis mikroba tertentu, dalam kondisi yang sesuai, untuk menyebabkan penyakit menular yang khas. Oleh karena itu, patogenisitas merupakan karakteristik spesies.

Polutan biologis yang menyebabkan berbagai penyakit pada manusia banyak ditemukan di lingkungan alam. Ini adalah mikroorganisme patogen, virus, cacing, dan protozoa. Mereka dapat ditemukan di atmosfer, air, tanah, dan di tubuh organisme hidup lainnya, termasuk manusia itu sendiri.

Patogen yang paling berbahaya adalah penyakit menular. Mereka memiliki stabilitas yang berbeda lingkungan. Ada pula yang mampu hidup di luar tubuh manusia hanya beberapa jam; berada di udara, di air, di berbagai benda, mereka cepat mati. Yang lain dapat hidup di lingkungan tersebut dari beberapa hari hingga beberapa tahun. Bagi yang lain, lingkungan adalah habitat alami mereka. Bagi organisme lain, organisme lain, seperti hewan liar, menyediakan tempat untuk konservasi dan reproduksi.

Seringkali sumber infeksi adalah tanah di mana patogen tetanus, botulisme, gangren gas, dan beberapa penyakit jamur terus-menerus hidup. Mereka bisa masuk ke tubuh manusia jika rusak. kulit, dengan makanan yang tidak dicuci, melanggar aturan kebersihan.

Antibiotik yang khas	Produser	Siapa yang terpengaruh?	Mekanisme aksi	Kesulitan dalam penggunaan terapeutik
Penisilin, sefalosporin	genera jamur Ulangnicillium, Cephalosporum	Bakteri gram positif dan gram negatif	Gangguan sintesis dinding sel	Reaksi alergi
Streptomisin, gentamisin, kanamisin, tobramisin, amikasin	genus Aktinomycetes Streptomyces, genera bakteri Mikromonospora. Basil­ bagus		Penghambatan sintesis protein yang ireversibel	Efek toksik pada saraf pendengaran dan ginjal
Antibiotik dengan nama yang sama	genus Aktinomycetes Streptomyces	Bakteri gram positif dan gram negatif, rickettsia, klamidia, protozoa	Penghambatan sintesis protein yang reversibel	Penyebaran strain yang resisten
Antibakteri: eritromisin Antijamur dan antiprotozoal: poliena	genus Aktinomycetes Streptomyces Sama	Bakteri gram positif Jamur, beberapa protozoa	Gangguan membran plasma	Toksisitas
Polimiksin, gramisidin, basitrasin	Berbagai mikroorganisme	Terutama bakteri gram negatif	Mekanisme kerjanya berbeda	Toksisitas tinggi