Rekombinasi genetik: transduksi, transformasi, konjugasi, transposisi. Konsep rekayasa genetika. Fitur membangun peta genetik pada prokariota Fitur transduksi dan konjugasi transformasi rekombinasi bakteri

Perubahan kombinasi.

Mereka muncul sebagai hasil dari transformasi dan konjugasi. Transformasi adalah proses mentransfer situs materi genetik DNA yang mengandung satu pasang nukleotida, dari sel donor ke sel reseptor.

Ada 5 tahapan dalam proses transformasi:

1) Adsorpsi DNA transformasi pada permukaan sel mikroba;

2) Penetrasi DNA ke dalam sel penerima;

3) Memasangkan DNA yang diperkenalkan dengan struktur kromosom sel;

4) Penggabungan sebagian DNA sel donor ke dalam struktur kromosom sel penerima;

5) Perubahan lebih lanjut dalam nukleotida selama pembelahan berikutnya. Suhu transformasi optimal adalah 29-32С.

Transduksi adalah perubahan di mana materi genetik sel donor ditransfer ke sel penerima oleh fag transduksi (temperate), yaitu. fag yang tidak menyebabkan kehancurannya.

Ada tiga jenis transduksi:

1) Umum (non-spesifik), dapat terjadi perpindahan berbagai atau beberapa tanda secara bersamaan.

2) Spesifik, dicirikan dengan pengalihan hanya fitur tertentu.

3) Abortif, wilayah DNA sel donor, yang ditransfer oleh fag ke dalam sel penerima, tidak termasuk dalam genomnya.

Konjugasi adalah suatu bentuk proses seksual di mana sel-sel mikroba jantan dan betina terhubung dan zat inti dipertukarkan di antara mereka.

Dalam hal ini, materi genetik sel donor masuk ke sel penerima. Setelah rekombinasi dan pembelahan sel, bentuk dengan tanda-tanda sel konjugasi terbentuk.

Dengan demikian, ketiga bentuk variabilitas kombinatif (transformasi, transduksi, konjugasi) berbeda dalam bentuk, tetapi pada dasarnya identik. Selama transformasi, sebagian DNA sel donor memasuki sel penerima, selama transduksi peran ini dilakukan oleh fag, dan selama konjugasi, transfer informasi genetik dilakukan melalui jembatan sitoplasma (pili).

Rickettsia

mikroba gram negatif. Bentuknya batang pendek atau cocci. Rickettsiae memiliki dinding sel yang mirip dengan bakteri Gram-negatif.

Mereka diklasifikasikan sebagai bakteri sejati. Prokariota.

Nitrifikasi.

Produk peluruhan protein dan dekomposisi urea, amonia dan garam amonium, dapat langsung diserap oleh tanaman, tetapi biasanya diubah menjadi asam nitrat nitrat.

Pada tahap pertama nitrifikasi, amonia dioksidasi menjadi asam nitrat sesuai dengan skema

DG = -662kJ/mol.

Proses nitrifikasi berlangsung dalam beberapa tahap, dengan pembentukan sejumlah produk antara: hidroksilamina, nitrooksida, dll.

Pada fase kedua, asam nitrat dioksidasi menjadi asam nitrat:

DG = -201kJ/mol.

Fase pertama dan kedua dari proses nitrifikasi tunggal disebabkan oleh patogen yang berbeda. S.N. Vinogradsky mengelompokkannya menjadi tiga genera:

1) Nitrosomonas. Mereka berbentuk batang, gram negatif, motil, dilengkapi dengan satu flagel, tidak membentuk spora. Mereka tersebar luas di tanah dan berbeda satu sama lain dalam bentuk dan ukuran.

2) Nitrosocystis. Mampu membentuk zoogley (mikroba kokus yang mengelilingi kapsul)

3) Nitrosospir. Mereka dibagi menjadi dua jenis. Bakteri dari kedua spesies memiliki bentuk spiral yang teratur. Seiring dengan benang yang dipilin secara spiral, tongkat pendek dan kokus ditemukan dalam budaya lama.

Baru-baru ini, dua genera mikroba telah diidentifikasi yang menyebabkan fase pertama nitrifikasi.

Bakteri nitrifikasi memiliki sikap negatif terhadap zat organik. Sensitivitas kuat mikroba nitrifikasi terhadap zat organik dicatat dalam larutan; ini tidak diamati di tanah, karena itu tidak pernah mengandung zat yang larut dalam air dalam jumlah yang signifikan.

Proses oksidasi amonia dipengaruhi tidak hanya oleh mikroba, tetapi juga oleh enzimnya. Selain bahan organik, nitrifikasi dipengaruhi oleh konsentrasi amonia. Efeknya pada kultur dimanifestasikan secara tajam dalam media cair. Di dalam tanah, amonia berada dalam keadaan teradsorpsi dan tidak dapat memberikan efek depresi. Oleh karena itu, nitrobacter segera mengoksidasi asam nitrat menjadi asam nitrat.

Kehadiran oksigen memiliki efek positif pada proses nitrifikasi. Di tanah yang dibudidayakan, proses nitrifikasi berlangsung lebih intensif.

Topik: Genetika mikroorganisme 1. Konjugasi, transduksi, transformasi. 2. Variabilitas mikroorganisme. 3. Penggunaan prestasi dalam genetika bakteri.

Aparatus herediter bakteri memiliki sejumlah fitur: bakteri adalah organisme haploid, yaitu, mereka memiliki 1 kromosom. Dalam hal ini, ketika mewarisi sifat, tidak ada fenomena dominasi; Bakteri memiliki tingkat reproduksi yang tinggi, sehubungan dengan itu beberapa puluh generasi bakteri diganti dalam waktu singkat (hari). Ini memungkinkan untuk mempelajari populasi yang sangat besar dan dengan mudah mengidentifikasi bahkan mutasi yang langka. Aparatus herediter bakteri diwakili oleh kromosom. Bakteri hanya memiliki satu. Kromosom bakteri adalah molekul DNA. Panjang molekul ini mencapai 1,0 mm dan, untuk "pas" dalam sel bakteri, itu tidak linier, seperti pada eukariota, tetapi superkoil menjadi loop dan dilipat menjadi cincin. Cincin ini pada satu titik melekat pada membran sitoplasma. Gen individu terletak pada kromosom bakteri. Di Escherichia coli, misalnya, ada lebih dari 2 ribu di antaranya.

2. Unit fungsional genom bakteri, selain gen kromosom, adalah: urutan-IS; transposon; plasmid. IS-sequences (penyisipan bahasa Inggris - penyisipan, urutan - urutan) - fragmen DNA pendek. Mereka tidak membawa gen struktural (mengkode protein tertentu), tetapi hanya mengandung gen yang bertanggung jawab untuk transposisi (kemampuan sekuens IS untuk bergerak di sepanjang kromosom dan berintegrasi ke berbagai wilayahnya). Urutan IS adalah sama untuk jenis yang berbeda bakteri. Transposon adalah molekul DNA yang lebih besar dari sekuens IS. Selain gen yang bertanggung jawab untuk transposisi, mereka juga mengandung gen struktural yang mengkode satu atau sifat lain. Transposon (elemen Tn) terdiri dari 2000-25.000 pasangan basa, mengandung fragmen DNA yang membawa gen spesifik, dan dua elemen terminal IS. Setiap transposon biasanya mengandung gen yang memberikan karakteristik penting bagi bakteri, seperti resistensi ganda terhadap agen antibakteri. Secara umum, transposon dicirikan oleh gen yang sama dengan plasmid (gen untuk resistensi antibiotik, produksi toksin, enzim metabolik tambahan). Transposon bergerak dengan mudah di sepanjang kromosom. Posisi mereka mempengaruhi ekspresi gen struktural mereka sendiri dan gen kromosom tetangga. Transposon juga bisa ada di luar kromosom,

Plasmid adalah molekul DNA melingkar superkoil. Berat molekul mereka sangat bervariasi dan bisa ratusan kali lebih besar daripada transposon. Plasmid mengandung gen struktural yang memberi sel bakteri berbagai sifat yang sangat penting untuknya: R-plasmid - resistensi obat; Col-plasmid - kemampuan untuk mensintesis colicins; F-plasmid - untuk mentransfer informasi genetik; Tox-plasmid - untuk mensintesis racun; Plasmid biodegradasi - menghancurkan satu atau lain substrat, dll. Plasmid dapat diintegrasikan ke dalam kromosom (tidak seperti sekuens dan transposon IS, mereka dibangun ke dalam area yang ditentukan secara ketat), atau mereka dapat eksis secara mandiri. Dalam hal ini, mereka memiliki kemampuan untuk replikasi mandiri, dan itulah sebabnya dapat ada 2, 4, 8 salinan plasmid semacam itu di dalam sel. Banyak plasmid mengandung gen transmisibilitas dan mampu dipindahkan dari satu sel ke sel lain selama konjugasi (pertukaran informasi genetik). Plasmid semacam itu disebut menular.

Pada bakteri, ada 2 jenis variabilitas - fenotipik dan genotipik. Variabilitas fenotipik - modifikasi - tidak mempengaruhi genotipe, tetapi mempengaruhi sebagian besar individu dalam populasi. Modifikasi tidak diwariskan dan memudar seiring waktu, yaitu, mereka kembali ke fenotipe asli setelah jumlah generasi yang lebih besar (modifikasi jangka panjang) atau lebih sedikit (modifikasi jangka pendek). h Variabilitas genotipe mempengaruhi genotipe. Ini didasarkan pada mutasi dan rekombinasi. Mutasi pada bakteri pada dasarnya tidak berbeda dengan mutasi pada sel eukariotik. Ciri mutasi pada bakteri adalah relatif mudah untuk dideteksi, karena dimungkinkan untuk bekerja dengan populasi bakteri yang besar. Berdasarkan asalnya, mutasi dapat: spontan; diinduksi. Dengan panjang: putus-putus; genetik; kromosom. Dengan arah: lurus; - balik.

Rekombinasi (pertukaran materi genetik) pada bakteri berbeda dari rekombinasi pada eukariota: bakteri memiliki beberapa mekanisme rekombinasi; selama rekombinasi pada bakteri, bukan zigot yang terbentuk, seperti pada eukariota, tetapi merozigot (membawa informasi genetik lengkap penerima dan bagian dari informasi genetik donor dalam bentuk suplemen); dalam sel rekombinan bakteri, tidak hanya kualitas, tetapi juga kuantitas perubahan informasi genetik.

Konjugasi Pada bakteri, suatu metode pemindahan materi genetik dari satu sel bakteri ke sel bakteri lainnya. Dalam hal ini, dua bakteri dihubungkan oleh jembatan tipis, di mana sepotong untai asam deoksiribonukleat (DNA) berpindah dari satu sel (donor) ke sel lain (penerima). Sifat herediter penerima berubah sesuai dengan jumlah informasi genetik yang terkandung dalam potongan DNA yang ditransfer.

Konjugasi Konjugasi (dari bahasa Latin conjugatio - koneksi), proses paraseksual - transfer searah dari bagian materi genetik (plasmid, kromosom bakteri) dengan kontak langsung dua sel bakteri. Dibuka pada tahun 1946 oleh J. Lederberg dan E. Taitem. Memiliki sangat penting di alam, karena mempromosikan pertukaran tanda-tanda yang berguna dengan tidak adanya proses seksual yang benar. Dari semua proses transfer gen horizontal, konjugasi memungkinkan transfer bilangan terbesar informasi genetik.

Konjugasi adalah pertukaran informasi genetik pada bakteri dengan mentransfernya dari donor ke penerima selama kontak langsung mereka. Setelah pembentukan jembatan konjugasi antara donor dan penerima, satu untai DNA donor memasuki sel penerima melalui itu. Semakin lama kontak, semakin banyak DNA donor yang dapat ditransfer ke penerima. Berdasarkan interupsi konjugasi pada interval tertentu, dimungkinkan untuk menentukan urutan gen pada kromosom bakteri - untuk membangun peta kromosom bakteri (untuk memetakan bakteri). F+-sel memiliki fungsi donor.

Transduksi Esther Lederberg berhasil mengisolasi bakteriofag lambda, virus DNA, dari Escherichia coli K12 tahun 1950. Penemuan transduksi sebenarnya dikaitkan dengan nama Joshua Lederberg. Pada tahun 1952, bersama dengan Norton Zinder, mereka menemukan transduksi total. Pada tahun 1953, Lederberg dkk menunjukkan adanya transduksi abortif, dan pada tahun 1956, transduksi spesifik.

Transduksi adalah pertukaran informasi genetik pada bakteri dengan mentransfernya dari donor ke penerima dengan bantuan bakteriofag sedang (transduksi). Fag transduksi dapat membawa 1 atau lebih gen (sifat). Transduksi terjadi: spesifik - gen yang sama selalu ditransfer; non-spesifik - gen yang berbeda ditransmisikan. Ini karena lokalisasi fag transduksi dalam genom donor: dalam kasus transduksi spesifik, mereka selalu berada di tempat yang sama pada kromosom; di nonspesifik lokalisasi mereka berubah.

Beras. 2. Transduksi 1 - bakteri - donor (B+), 2 - fag, 3 - reproduksi, 4 - adsorpsi, 5 - bakteri - penerima (B-), 6 - bakteri - penerima dengan sifat baru.

Transformasi adalah pertukaran informasi genetik pada bakteri dengan memasukkan preparat DNA yang sudah jadi (disiapkan secara khusus atau diisolasi langsung dari sel donor) ke dalam sel bakteri penerima. Paling sering, transfer informasi genetik terjadi ketika penerima dibudidayakan pada media nutrisi yang mengandung DNA donor. Untuk persepsi DNA donor selama transformasi, sel penerima harus dalam keadaan fisiologis (kompetensi) tertentu, yang dicapai dengan metode khusus memproses populasi bakteri atau terjadi secara spontan. Selama transformasi, tanda tunggal (biasanya 1) ditransmisikan. Transformasi adalah bukti paling objektif dari asosiasi DNA atau fragmennya dengan satu atau lain sifat fenotipik, karena persiapan DNA murni dimasukkan ke dalam sel penerima.

Beras. 3. Transformasi strain kapsuler bakteri (1) selama penyemaian memberikan pertumbuhan (6). Setelah kultur ini direbus, tidak ada pertumbuhan (7). Hasil eksperimen semacam itu dengan galur tanpa kapsul (4 -pertumbuhan +, 8 -pertumbuhan -) serupa. Menggabungkan dalam satu wadah ekstrak singkong (1) dan kultur hidup galur non-kapsul (3), diikuti dengan penyemaian, menghasilkan pertumbuhan galur kapsul (5).

Sifat sel koloni Bentuk S dan R Bentuk S Bentuk R Koloni kasar, buram dengan tepi tidak rata, sering berkerut Flagela sering tidak ada Kapsul atau lapisan mukosa tidak ada Secara biokimia kurang aktif Lemah virulen atau avirulen Cacat antigenik Sangat sensitif terhadap phage Suspensi cepat mengendap, endapan rapuh, sel polimorfik Koloni transparan, dengan permukaan halus mengkilap, bulat, dengan tepi halus, cembung Spesies motil memiliki flagela Spesies kapsul memiliki kapsul atau lapisan mukosa yang terlihat jelas Secara biokimia lebih aktif Sifat virulen diekspresikan pada spesies patogen Antigen lengkap Sensitif terhadap fag Sel suspensi dalam sel salin homogen, stabil, ukuran normal

Rekombinasi genetik pada eukariota adalah pembentukan individu dengan kombinasi sifat baru sebagai hasil dari proses seksual. Seorang individu baru menerima beberapa gen dari satu orang tua dan beberapa dari yang lain, orang tua yang berbeda secara genetik. Proses rekombinasi meningkatkan jumlah perubahan turun temurun yang dapat dipengaruhi oleh seleksi.

Pada prokariota, rekombinasi genetik mengacu pada apa yang disebut proses paraseksual. Dalam organisme ini, tiga proses diketahui dimana materi genetik dari dua orang tua yang berbeda dapat bergabung kembali. Ini adalah transformasi, konjugasi dan transduksi. Namun, tidak satu pun dari proses ini yang melibatkan fusi sel sejati atau fusi lengkap nukleoid. Hanya sebagian materi genetik sel donor yang ditransfer ke sel penerima. Penerima dengan demikian menjadi diploid karena beberapa materi genetiknya dilengkapi dengan materi genetik donor.

Dalam zigot yang tidak lengkap, yang disebut merozigot, terbentuk sebagai hasil transfer gen, materi genetik sel penerima disebut endogen, dan fragmen genetik yang ditransfer dari donor disebut eksogen. Biasanya, bagian eksogen dan endogen bergabung dan bertukar segmen segera setelah transfer.

Transformasi adalah proses transfer gen di mana sebagian DNA dari sel donor, yang diperoleh baik dengan ekstraksi atau lisis sel alami, dapat memasuki sel resipien bakteri yang terkait (dari spesies yang sama atau terkait erat). Akibatnya, fragmen kromosom DNA donor masuk ke dalam DNA penerima, yang menyebabkan perubahan karakteristik bakteri penerima.

Proses transformasi dapat dibagi menjadi beberapa tahap: 1 - kontak DNA dengan permukaan sel; 2 - penetrasi DNA ke dalam sel; 3 - koneksi DNA yang mengubah dengan fragmen yang sesuai dari kromosom penerima. Proses selanjutnya dikaitkan dengan rekombinasi bagian dari molekul DNA transformasi eksogen dengan DNA kromosom endogen penerima. Panggung terakhir- Replikasi informasi baru termasuk dalam kromosom.

Dalam kondisi laboratorium, transformasi dilakukan sebagai berikut. DNA dari strain bakteri tertentu diekstraksi, dimurnikan dan dicampur dengan sel bakteri dari strain lain yang berbeda dari yang pertama dalam satu atau lebih sifat herediter. Kultur mikroorganisme uji dibiarkan tumbuh. Di antara keturunannya, sejumlah kecil sel dapat ditemukan dengan beberapa sifat strain dari mana DNA diekstraksi.

Jarang terjadi bahwa satu sel bakteri memperoleh lebih dari satu sifat baru sebagai hasil transformasi. Transmisi melalui DNA dari sejumlah besar sifat diamati hanya jika kultur mikroba donor secara genetik dekat dengan sel-sel mikroba penerima.

Dengan bantuan transformasi DNA, sifat-sifat seperti pembentukan kapsul, sintesis zat yang diperlukan untuk sel, aktivitas enzimatik, resistensi terhadap racun, antibiotik, dan lainnya dapat ditularkan. zat obat.

Transformasi diamati pada banyak bakteri, khususnya, pada perwakilan dari genus Bacillus, Rhizobium, Streptococcus, dll.

Konjugasi- sebuah proses di mana sel induk yang didekati biasanya dihubungkan dengan bantuan jembatan konjugasi, melalui yang terakhir ada pertukaran materi genetik. Konjugasi telah dipelajari di berbagai bakteri (Escherichia, Shigella, Salmonella, Pseudomonas), khususnya, telah dipelajari dengan baik di Escherichia coli.

Kemampuan sel untuk menjadi donor ditentukan oleh faktor jenis kelamin spesifik F (dari kesuburan Inggris - kesuburan), yang, selama konjugasi, ditransfer dari satu sel bakteri ke sel bakteri lainnya. Sel-sel ini disebut sel F+. Sel bakteri yang tidak memiliki faktor F merupakan penerima materi genetik dan diberi nama F - Faktor kelamin F adalah salah satu plasmid konjugatif dan merupakan molekul DNA tertutup sirkular dengan berat molekul 64x106 a. makan. Plasmid-F menyebabkan pembentukan satu atau dua yang disebut pili seks, atau F-pili, pada permukaan sel, yang memfasilitasi hubungan sel donor dengan sel penerima, serta replikasi independen kromosom dari DNA-nya sendiri dan pembentukan produk yang memastikan transfer materi genetik sebagai plasmid F dan kromosom sel terbanyak. F-plasmid terletak secara otonom di sitoplasma, di luar kromosom bakteri. Namun, ia memiliki kemampuan untuk dimasukkan (dan diintegrasikan) ke dalam tempat-tempat tertentu kromosom bakteri dan menjadi bagian darinya.

Sebagai hasil dari integrasi F-plasmid ke dalam komposisi kromosom bakteri, apa yang disebut Hfr-strain (Frekuensi rekombinasi tinggi - frekuensi rekombinasi tinggi) terbentuk. Ketika galur Hfr disilangkan dengan bakteri F - -, maka, sebagai aturan, faktor F - tidak

Ditransmisikan, dan gen kromosom bakteri ditransmisikan dengan cukup frekuensi tinggi. Pada awal proses konjugasi, sel donor F+ atau Hfr terhubung ke sel penerima (karena adanya F-pili pada donor). Selanjutnya, jembatan konjugasi terbentuk antara sel dan melalui itu, dari sel donor ke sel penerima, materi genetik atau F-plasmid atau kromosom ditransfer. Biasanya, selama konjugasi, hanya satu untai DNA donor yang ditransfer, dan untai kedua (komplementer) diselesaikan di sel penerima. Pemindahan, sebagai suatu peraturan, dimulai pada salah satu ujung kromosom dan berlanjut dengan pemindahan bagian lain darinya (Gbr. 21).

Perpindahan materi genetik dapat dicegah setiap saat dengan memisahkan pasangan konjugasi dengan mengocok suspensi mikroorganisme dengan kuat dalam media cair. Dalam hal ini, hanya beberapa sifat sel jantan yang ditransfer ke sel betina dan dapat memanifestasikan dirinya pada keturunannya. Cepat atau lambat, transfer berhenti di sebagian besar pasangan konjugasi bahkan ketika mereka tidak dipisahkan secara artifisial. Hal ini karena jembatan konjugasi rapuh dan mudah hancur tanpa mempengaruhi viabilitas sel.

Jadi, sebagai hasil konjugasi, sel penerima F - berubah menjadi merozigot yang mengandung, karena gangguan spontan transfer materi genetik, hanya sebagian dari kromosom donor F + selain kromosomnya sendiri. Sebagai hasil dari proses pindah silang (persilangan kromosom, di mana gen berubah tempat), yang juga diamati pada organisme lain, kombinasi baru materi genetik terbentuk. Tergantung pada lokasi materi genetik yang dipertukarkan, berbagai jenis rekombinan dapat terjadi pada keturunannya.

transduksi- proses pemindahan materi genetik dari satu sel bakteri ke sel bakteri lainnya melalui bakteriofag. Dengan kata lain, fag pada saat yang sama berperan sebagai gamet, mentransfer fragmen DNA dari sel donor ke dalam sel penerima. Transduksi terjadi dengan partisipasi fag beriklim sedang.

Tiga jenis utama transduksi diketahui: umum (non-spesifik), lokal (spesifik), dan gagal. Dalam transduksi nonspesifik, berbagai fragmen DNA ditransfer dari bakteri donor ke bakteri penerima dengan bantuan fag transduksi moderat. Dalam hal ini, fragmen DNA donor yang dibawa oleh fag dapat dimasukkan ke dalam wilayah DNA homolog sel penerima melalui rekombinasi.

Transduksi spesifik ditandai dengan kemampuan fag untuk mentransfer hanya gen tertentu dari bakteri donor ke bakteri penerima. Ini disebabkan oleh fakta bahwa pembentukan fag transduksi terjadi sebagai hasil dari kombinasi DNA-nya dengan gen bakteri yang ditentukan secara ketat yang terletak pada kromosom sel donor. Diyakini bahwa setiap partikel fag hanya membawa satu gen bakteri atau beberapa gen di dekatnya.

Pada Transduksi yang gagal Fragmen kromosom sel donor yang dibawa oleh fag tidak termasuk dalam kromosom sel penerima, tetapi terletak secara otonom di sitoplasmanya dan dapat berfungsi dalam bentuk ini. Dalam proses pembelahan sel - penerima, fragmen DNA yang ditransduksi - donor hanya dapat ditransfer ke salah satu dari dua sel anak, yaitu, diwariskan secara unilinear, dan karena itu hilang pada keturunannya.

Selama transduksi, dimungkinkan untuk mentransfer gen yang mengontrol karakteristik nutrisi bakteri, ketahanannya terhadap obat, aktivitas enzimatik, sistem lokomotor(flagela) dan sifat-sifat lainnya.

Pemindahan sifat menggunakan proses transduksi ditemukan pada perwakilan genera Bacillus, Pseudomonas, Salmonella, Escherichia, dll.

Transformasi - perubahan sifat herediter sel sebagai akibat penetrasi atau pengenalan buatan DNA asing ke dalamnya. Sifat dari faktor transformasi ditetapkan oleh Avery dan McLeod pada tahun 1944. Adalah mungkin untuk mengubah hanya bakteri-bakteri yang sel-selnya dapat ditembus oleh DNA untai ganda (utuh) dengan molekul tinggi. Kemampuan untuk menyerap DNA adalah kompetensi, dan tergantung pada keadaan fisiologis sel. DNA dapat diambil selama fase singkat tertentu dari perubahan permukaan sel. Dengan bantuan DNA, sifat-sifat tersebut dapat ditransmisikan sebagai: pembentukan kapsul, sintesis in-in, aktivitas enzimatik, resistensi terhadap racun, antibiotik .. DNA apa pun dapat menembus ke dalam sel yang kompeten, tetapi hanya DNA dari spesies terkait yang dapat bergabung kembali . Konjugasi - transfer materi genetik melalui kontak langsung antara 2 sel. Diselidiki oleh Lederberg dan Tatum pada tahun 1946 pada mutan E. coli. Satu mutan membutuhkan asam amino A dan B, tetapi mampu mensintesis Cu D, yang kedua kompeten untuk itu (A-B-C+D+). Mutan ini tidak tumbuh dan tidak membentuk koloni pada media nutrisi minimal, tetapi jika suspensi kedua mutan ditambahkan ke dalamnya, koloni muncul. Sel-sel koloni ini memiliki kemampuan turun-temurun untuk mensintesis semua asam amino (A + B + C + D +).Di sini, konjugasi berfungsi sebagai prasyarat untuk rekombinasi. Pada penelitian bakteri ditemukan bahwa kemampuan sel untuk menjadi donor berhubungan dengan adanya faktor F (sel F+ yang tidak mengandung faktor – F- dan dapat berfungsi sebagai penerima) – a plasmid, molekul DNA untai ganda melingkar. Itu. sel penerima menjadi donor sebagai hasil konjugasi, dan sifat kromosom tidak ditransmisikan. F-plasmid menyebabkan pembentukan genital fimbriae/F-pili pada sel, yang berfungsi untuk pengenalan pada kontak antara sel donor dan sel penerima dan memungkinkan untuk membentuk jembatan yang dilalui DNA ke dalam sel. Konjugasi umum terjadi pada enterobakteri, prokariota. Transduksi - transfer pasif gen bakteri dari satu sel ke sel lain oleh partikel bakteriofag, yang menyebabkan perubahan sifat herediter sel. Ada 2 jenis transduksi: a) Non-spesifik - di mana setiap fragmen DNA inang dapat ditransfer (DNA sel inang termasuk dalam partikel fag / ke gennya sendiri / sebagai gantinya); b) Spesifik - fragmen DNA yang didefinisikan secara ketat dapat ditransfer; beberapa gen fag digantikan oleh gen inang). Dalam kedua kasus, fag rusak; kehilangan kemampuan untuk melisiskan sel.

38. Faktor resistensi (faktor-r). sifat-sifat plasmid. Transposon.

1. perlawanan- org-mov resisten terhadap antigen apa pun. Bakteri yang resisten terhadap antibiotik tertentu telah ditemukan. Pada tahun 50-an di Jepang (agen penyebab disinteria. Perhatikan banyaknya bakteri. disinteria dan ini dapat menyebabkan bakteri lain. Faktor R mengandung gen yang membuat sel resisten terhadap antibiotik tertentu. Beberapa faktor R menyebabkan resistensi segera terhadap 8 antibiotik , dan R-ph lain memberi kita kemampuan untuk logam berat (merkuri, nikel, kadmium) R-plasmid membawa 2 kelompok gen: 1) gen yang bertanggung jawab untuk transfer plasmid dengan konjugasi (tra ) dan mereka arr. -disebut "resistance transfer factors (RTF), 2) gen yang menentukan resistensi itu sendiri dan mereka comp. Hanya terdiri dari sebagian kecil plasmid.

RTF mencakup semua gen yang bertanggung jawab untuk transfer faktor R dari sel ke sel, yang dilakukan dengan konjugasi. Artinya, faktor R serta faktor F menular. Transfer faktor-R antara beberapa genera bakteri yang berbeda dimungkinkan, yang berkontribusi pada distribusi lebih lanjut. Modifikasi kimia enzimatik antibiotik adalah penyebab utama konsumsi karena plasmid. Misalnya, kanamisin dan neomisin menjadi sasaran fosforelasi, sementara pinpicin dinonaktifkan oleh penisilinase. pos. Saat tersedia Faktor-R, gen, rekombinasi dimungkinkan, kemudian kombinasi gen baru dapat muncul, yang akan memberikan sifat tambahan. R-faktor sangat penting untuk kemoterapi.

2. Bakteriosin. Banyak bact.synthesis.proteins, Yukotor. Membunuh spesies atau galur terkait atau menghambat pertumbuhannya. Protein ini disebut bakteriosin. Mereka adalah seorang pembuat kode. Khusus.plasmid, yang.bernama.faktor bakteriosinogenik. Bakteriosin telah diisolasi dari Esrichia coli (colicins) dan bakteri lainnya. Nama bakteriosin diberikan sesuai dengan bentuk bakteri penghasilnya, misalnya staphylococci yang dihasilkan oleh staphylocins. anorganik, membunuh bakteri yang disebut antiseptik.

3. Pengenalan lainnya, ditentukan oleh plasmid. Plasmid mungkin mengandung gen yang menyebabkan sejumlah biol tertentu. Gen enzim yang diperlukan untuk pemecahan campyphora, asam salat, dan substrat esensial lainnya dapat ditemukan dalam plasmid. Daftar sv-in, diwarisi dengan plasmid, berarti dan meliputi: fiksasi nitrogen, arr-e nodul, penyerapan gula, sintesis hidrogenase, dll. Beberapa sv-in ini dapat ditentukan oleh gen bakteri. Kromosom (pertukaran gen m-du kromosom dan plasmid). Plasmid telah memainkan peran penting dalam evolusi prokariota.

4. Ketidakcocokan. Banyak bact.contents.plasmid dengan berbagai ukuran. Adanya plasmid yang berbeda dalam satu sel menunjukkan bahwa plasmid tersebut kompatibel satu sama lain. Tetapi 2 plasmid terkait tidak dapat hidup berdampingan dalam sel yang sama, mereka tidak kompatibel. Semua plasmid lain pada kelompok inkompatibilitas: plasmid, relatif terhadap kelompok inkompatibilitas yang sama.

Transposon - ini adalah DNA terakhir, yang mampu diintegrasikan ke dalam banyak bagian genom dan dapat "dipindahkan" dari plasmid ke bakt.kromosom, ke plasmid lain. Transpason mengandung gen yang menentukan tanda-tanda eksternal, yaitu, mereka resisten terhadap antibiotik seperti pinic, tetrasiklin, dll. Dalam hal ini, mereka lebih mudah dideteksi daripada IS - El-you (DNA asing, diwakili oleh .serangkaian pertemuan penyisipan di bakt.kromosom dan plasmid.). Di kedua sisi gen, situs yang terletak di dalam transposon terletak 2 dalam urutan yang sama, yang dapat berjalan ke arah yang sama atau berlawanan. Pengulangan basa DNA ini sebagian identik dengan IS - El-tami.

41. Evolusi m / s.

Sel-sel semua makhluk hidup, dari bentuk primitif hingga yang sangat terorganisir, terdiri dari elemen struktural yang sama dan menggunakan mekanisme yang sama untuk memperoleh energi dan pertumbuhan. Ini adalah kesatuan biokimia dari semua organisme hidup. Dalam proses evolusi, pembentukan dan pembentukan berbagai bentuk makhluk hidup terjadi. Untuk proses evolusi kehidupan, perlu untuk membayangkan kondisi apa yang ada di Bumi, di mana generasi kehidupan secara spontan menjadi mungkin. Pada periode terakhir setelah pembentukan Bumi, proses biologis aktif terjadi di atasnya, yang mengubah penampilannya dan mengarah pada pembentukan kerak bumi, hidrosfer, dan atmosfer. Ketika bahan organik terakumulasi di Bumi dalam jumlah besar => kondisi muncul di mana transisi dari evolusi kimia ke munculnya makhluk hidup yang mereproduksi diri pertama dapat terjadi. Merupakan ciri sel kehidupan yang selalu muncul dalam bentuk struktur tertentu yang secara spasial terisolasi dari lingkungan luar, tetapi terus berinteraksi dengannya dalam bentuk sistem terbuka. Dia berasumsi bahwa tahap evolusi selanjutnya di jalur munculnya kehidupan adalah pembentukan organisasi struktural tertentu - senyawa organik yang disintesis secara abiogenik. Mereka memiliki bentuk bulat, diameter 0,5-7 mikron, menyerupai bentuk bakteri kokoid, mengandung proteinoid, dan memiliki stabilitas tertentu. Pada pewarnaan gram, ditemukan bahwa mikrosfer terbentuk dari proteinoid asam - gr-, dan proteinoid utama - gr +. Tahap ini merupakan tahap transisi dari evolusi kimia ke biologi, dan pola yang dihasilkan dapat didefinisikan sebagai seleksi alam prabiologis. Di masa depan, ia menyarankan agar prokariota pertama, kucing, dapat muncul di badan air di mana banyak zat organik di pulau-pulau itu adalah organisme yang ada karena fermentasi dan memiliki fungsi utama metabolisme anaerobik. Jika kita berasumsi bahwa sulfat juga ada di badan air, maka tahap evolusi berikutnya adalah pengangkutan elektron yang efisien dengan penciptaan potensi proton sebagai sumber energi untuk regenerasi ATP. Selain itu, secara eksperimental ditunjukkan bahwa pada tahap awal evolusi, prokariota dapat mereproduksi dan mengirimkan informasi kepada keturunannya tanpa partisipasi asam nukleat. Untuk evolusi prokariota lebih lanjut, perlu untuk membuat peralatan khusus yang akan memberikan reproduksi polipeptida yang akurat. Ini mengarah pada pembentukan mekanisme sintesis baru - sintesis templat, yang didasarkan pada penggunaan sifat-sifat polinukleotida. Sifat molekul polinukleat adalah kemampuan untuk bereproduksi secara akurat, berdasarkan prinsip komplementaritas struktural.

Peristiwa utama dalam evolusi: transisi dari atmosfer reduksi primer ke atmosfer yang mengandung oksigen. Bakteri memiliki jenis metabolisme baru - respirasi aerobik, yang menjadi mungkin sebagai hasil dari transformasi sitokrom menjadi oksidase terminal, menggunakan molekul O 2 sebagai akseptor elektron. Diasumsikan bahwa 2 miliar tahun yang lalu semua prokariota fototrofik sudah ada, kucing masih dikenal sampai sekarang. Prokariota awalnya menempati banyak relung ekologi yang berbeda, tetapi kemudian secara bertahap memberi jalan kepada eukariota. Perkembangan berbagai jenis metabolisme pada prokariota disebabkan oleh struktur sel yang sederhana, sistem regulasi yang sangat berkembang, pertumbuhan yang cepat, dan adanya beberapa mekanisme transfer gen.

42.PATOGEN DAN KEKEBALAN MIKROORG.

Kekebalan melindungi kita dari agen infeksi: bakteri, virus, dan protozoa, yaitu, melindungi tubuh dari segala sesuatu yang asing.

Infeksi adalah proses biologis kompleks yang terjadi sebagai akibat dari penetrasi mikroba patogen ke dalam tubuh dan pelanggaran keteguhan lingkungan internalnya.

Patogenisitas adalah kemampuan mikroba dari spesies tertentu, dalam kondisi yang sesuai, untuk menyebabkan karakteristik penyakit menular darinya. Oleh karena itu, patogenisitas adalah sifat spesies.

Di lingkungan alam terdapat pencemar biologis yang menimbulkan berbagai penyakit pada manusia. Ini adalah patogen, virus, cacing, protozoa. Mereka bisa berada di atmosfer, air, tanah, di dalam tubuh organisme hidup lainnya, termasuk dalam diri orang itu sendiri.

Patogen paling berbahaya dari penyakit menular. Mereka memiliki stabilitas yang berbeda dalam lingkungan. Beberapa dapat hidup di luar tubuh manusia hanya untuk beberapa jam; berada di udara, di air, di berbagai objek, mereka dengan cepat mati. Orang lain mungkin hidup di lingkungan dari beberapa hari sampai beberapa tahun. Bagi yang lain, lingkungan adalah habitat alami. Untuk keempat – organisme lain, seperti hewan liar, merupakan tempat konservasi dan reproduksi.

Seringkali sumber infeksi adalah tanah, yang terus-menerus dihuni oleh patogen tetanus, botulisme, gangren gas, dan beberapa penyakit jamur. Mereka dapat masuk ke tubuh manusia jika kulitnya rusak, dengan makanan yang tidak dicuci, atau jika aturan kebersihan dilanggar.

Antibiotik khas	Produser	Siapa yang terpengaruh?	Mekanisme aksi	Kesulitan dalam aplikasi terapeutik
Penisilin, sefalosporin	genus jamur Ulangnicillium, Cephalosporum	Bakteri gram positif dan gram negatif	Pelanggaran sintesis dinding sel	reaksi alergi
Streptomisin, gentamisin, kanamisin, tobramisin, amikasin	Actinomycetes dari genus Streptomyces, bakteri melahirkan Mikromonospora. basil­ lus		Penghambatan ireversibel sintesis protein	Efek toksik pada saraf pendengaran dan ginjal
Antibiotik dengan nama yang sama	Actinomycetes dari genus Streptomyces	Bakteri gram positif dan gram negatif, riketsia, klamidia, protozoa	Penghambatan reversibel sintesis protein	Penyebaran strain resisten
Antibakteri: eritromisin Antijamur dan antiprotozoal: poliena	Actinomycetes dari genus Streptomyces Juga	Bakteri gram positif Jamur, beberapa protozoa	Gangguan membran plasma	Toksisitas
Polimiksin, gramisidin, basitrasin	Berbagai mikro organisme	Sebagian besar bakteri Gram-negatif	Mekanisme aksinya berbeda	Toksisitas tinggi

infeksi pencernaan mikroba

Rekombinasi adalah proses pertukaran materi genetik dengan memecah dan menggabungkan molekul yang berbeda. Rekombinasi terjadi dalam perbaikan pemutusan untai ganda pada DNA dan untuk melanjutkan replikasi jika terjadi penghentian garpu replikasi pada eukariota, bakteri, dan archaea. Virus dapat bergabung kembali di antara molekul RNA genom mereka.

Rekombinasi pada eukariota biasanya terjadi selama persilangan selama meiosis, khususnya selama pembentukan spermatozoa dan telur pada hewan. Rekombinasi, bersama dengan replikasi DNA, transkripsi RNA, dan translasi protein, termasuk dalam rekombinasi Homolog awal.

Rekombinasi homolog

Klasifikasi jenis rekombinasi homolog: alelik, ektopik dan homeolog; timbal balik (crossing over) dan non-timbal balik (konversi gen).

rekombinasi timbal balik. Ide awal tentang sifat pindah silang: hipotesis "break and join" dan "selective copy". Eksperimen Meselson tentang bukti mekanisme "putus dan sambung". Pengembangan pendekatan metodologis untuk mempelajari mekanisme molekuler rekombinasi. Dua tahap pembentukan DNA rekombinan: molekul "bersama" dan rekombinan primer.

Kontrol genetik rekombinasi homolog pada bakteriofag. Sistem Merah pada bakteriofag l. Eksonuklease l. Sistem Orf. Bakteriofag T4: peran gen 30, 32, 43, 46, 47, 49 dan uvsX. Enzimologi reaksi rekombinasi: endo dan eksonuklease, DNA polimerase, DNA ligase, protein UvsX, protein SSB dan protein lainnya. Proses "perpindahan untai", pembentukan D-loop, "migrasi cabang", koreksi heteroduplex. Tahap utama pindah silang adalah prasinapsis, sinapsis, dan pascasinapsis. Pola pindah silang pada bakteriofag. Umum dari rekombinasi DNA dan proses perbaikan.

Model dasar rekombinasi homolog. Model liburan. Latar belakang model, esensi, nilai. Pengembangan model dalam studi selanjutnya, kondisinya saat ini. Model Meselson-Reading. Sebuah model DNA double-strand break repair (DNR) dalam ragi (Zhostak et al.) yang diterapkan untuk pindah silang dan konversi.

Rekombinasi selama transformasi DNA kromosom pada bakteri. parameter rekombinasi. Ukuran fragmen DNA donor terintegrasi. Kinetika dan efisiensi transformasi. Bukti integrasi fragmen untai tunggal DNA donor. Kontrol genetik dan tahapan utama proses transformasi pada Bacillus subtilis dan Streptococcus pneumoniae. Kompleks donor-penerima. Kontrol genetik dan mekanisme rekombinasi selama transformasi di Haemophilus influenzae. Transformosom.

Rekombinasi selama konjugasi pada Escherichia coli. Karakterisasi transfer konjugasi DNA. Mekanisme integrasi DNA donor ke dalam kromosom sel penerima.

Kontrol genetik rekombinasi homolog di E. coli. Gen yang terlibat dalam presinapsis: recA, recB, recC, recD, recE, recJ, dll. Efek pleiotropik dari mutasi recB dan recC. Nuklease RecBCD yang bergantung pada ATP, aktivitasnya, mekanisme aksi dan perannya dalam berbagai proses genetik. Situs Chi sebagai hotspot rekombinasi. Universalitas nuklease yang bergantung pada ATP untuk bakteri. Gen yang mengontrol proses sinapsis: recA, recF, recO, recR, ssb, dll. Sifat mutan recA. Protein RecA, karakteristiknya. Reaksi dikatalisis oleh protein RecA, peran kuncinya dalam tahap pertama dari proses crossover: presinapsis dan sinapsis. Sifat sinapsis dalam rekombinasi homolog. Filamen DNA RecA, struktur dan fungsinya dalam rekombinasi. Skema crossover pada E. coli yang melibatkan RecBCD nuclease dan protein RecA. Homolog RecA pada organisme prokariotik dan eukariotik lainnya. Peran protein SSB. Gen pasca-sinapsis: ruvA, ruvB, ruvC, recG dan produknya. Peran dalam implementasi migrasi semi-chiasm Holliday dan dalam resolusinya.

Mutasi supresor pada sbcA, sbcB, sbcC dan sbcD. Eksonuklease I dan VIII. nuklease SbcCD. Tiga jalur rekombinasi DNA kromosom pada E. coli K-12 menurut Clark: RecBCD, RecF dan RecE, karakteristiknya. Peran jalur RecF dan RecE dalam rekombinasi homolog plasmid.

Fitur proses pindah silang pada eukariota. pindah silang meiotik. Peran kompleks sinaptonemal. Kontrol genetik rekombinasi meiosis. Keanekaragaman protein mirip RecA (rekombinasi) pada eukariota.

Persilangan mitosis: hubungan antara rekombinasi timbal balik dan non-timbal balik. Pindah silang dalam sel G1. Perbedaan dalam kontrol genetik persilangan meiosis dan mitosis pada ragi saccharomycete.

Hotspot rekombinasi pada eukariota. Peran DNA DNR dalam inisiasi persilangan meiosis dan mitosis.

Perbaikan rekombinasi DNR dalam DNA kromosom dan plasmid dalam ragi. Kontrol genetik dan berbagai mekanisme: model Zhostak dkk. dan modifikasinya, “break and copy”, “anil untai DNA komplementer” (“anil untai tunggal”), mekanisme “ligasi yang bergantung pada homolog”.

Rekombinasi ektopik, kontrol genetiknya, mekanisme molekuler dan signifikansi biologisnya.

Konversi gen (koreksi heteroduplex rekombinasi). Non-timbal balik rekombinasi intragenik. Hipotesis koreksi ketidakcocokan (Hallyday). Kontrol genetik dan cara untuk memperbaiki heterodupleks pada E. coli. Sistem untuk memperbaiki basa yang tidak berpasangan dengan pembentukan dan pembentukan celah yang diperluas di heteroduplex. Sistem HLSU Mut, karakteristiknya. Model molekuler koreksi heteroduplex dengan partisipasi sistem MutHLSU. Konservatisme evolusi protein MutL dan MutS. Peran protein MutL dan MutS dalam proses koreksi basa yang tidak berpasangan dan dalam regulasi rekombinasi homeolog. Sistem koreksi ketidaksesuaian pada E. coli dengan pembentukan dan pengisian celah pendek. Koreksi heterodupleks selama transformasi bakteri, kontrol genetiknya (sistem Hex), berpengaruh pada hasil pemetaan genetik. Koreksi dan interferensi negatif yang tinggi.

Konversi gen pada eukariota. Analisis tetrad persilangan interalel. Jenis-jenis notebook. Polaritas konversi, penyebabnya. konversi ulang. Panjang bagian konversi. Pertanyaan tentang hubungan antara konversi meiosis dan rekombinasi timbal balik dari penanda panggul. Konversi gen alelik mitosis. Konversi meiosis dan mitosis ektopik. Pergantian lokus MAT dalam ragi homothallic. Kontrol genetik konversi gen pada ekariota menggunakan ragi dan manusia sebagai contoh. Homolog eukariotik protein bakteri MutL dan MutS - keluarga protein PMS, MHL, MHS, dll., Fungsinya dalam rekombinasi dan proses seluler lainnya. Kompleksitas sistem koreksi ketidakcocokan pada eukariota berdasarkan partisipasi berbagai homolog protein bakteri MutL dan MutS.

Peran konversi dalam evolusi dan ontogeni. Hubungan antara proses crossover dan konversi dalam sistem genetik yang berbeda. Proses konversi yang terjadi secara independen dari pindah silang.

Proses rekombinasi yang tidak membutuhkan homologi untuk sinapsis

Rekombinasi khusus situs. Distribusi sistem rekombinasi situs-spesifik pada prokariota dan eukariota, fungsinya. Topoisomerase spesifik lokasi tipe I sebagai protein kunci rekombinasi spesifik lokasi pada bakteriofag, bakteri, dan ragi. Dua famili topoisomerase I spesifik lokasi adalah integrase dan resolvase.

Rekombinasi situs-spesifik selama integrasi dan eksisi fag l. skema Campbell. Perbedaan peta genetik fag vegetatif dan profag. Struktur situs attP dan attB. Sistem Int. Protein int sebagai perwakilan dari keluarga integrase. Protein E.coli IHF. intasoma. Model molekuler integrasi dan eksisi fag l. Penjajaran antiparalel situs att selama sinapsis. Sifat sinapsis dalam rekombinasi situs-spesifik.

Inversi DNA spesifik lokasi pada bakteriofag dan bakteri (sistem Din) dan pada ragi. Protein rekombinasi kunci adalah invertase sebagai anggota keluarga resolvas. Enhancer rekombinasi untuk inversi khusus situs. Protein Fis E.coli. terbalik. Model molekuler rekombinasi yang dilakukan oleh resolvases. Peran inversi spesifik situs dalam regulasi ekspresi gen.

Transposisi elemen genetik seluler. Transposisi pada prokariota. Elemen genetik bergerak: elemen IS, transposon (Tn), Mu fag. Struktur elemen bergerak. Fungsi dikendalikan oleh berbagai elemen bergerak. transposase. Partisipasi protein sel inang dalam transposisi. Pertanyaan tentang kekhususan integrasi elemen seluler ke dalam target DNA. Kesamaan reaksi yang membentuk proses transposisi dalam berbagai jenis elemen seluler prokariota dan eukariota.

Organisasi genetik transposon sederhana dari keluarga Tn3. gen tnpA dan tnpR, produknya. Transposisi replikatif, dua langkah proses. Model molekul Shapiro. Kontrol genetik dan mekanisme molekuler transposisi non-replikatif dalam transposon kompleks Tn5, Tn9 dan Tn10. Kontrol genetik dan mekanisme transposisi di fag Mu. transposom.

Transposon konjugatif bakteri gram positif dan gram negatif, klasifikasinya. Kontrol genetik dan mekanisme transposisi. signifikansi biologis.

Elemen genetik seluler eukariota (ragi, tumbuhan, Drosophila, mamalia). Klasifikasi elemen seluler eukariotik. Unsur dengan struktur tipe prokariotik. Retrotransposon tipe I pada ragi, tumbuhan dan hewan, strukturnya, kontrol genetik dan mekanisme transposisi, klasifikasi. Retrotransposon tipe II: fitur struktural, distribusi, mekanisme transposisi.

Efek genetik yang disebabkan oleh elemen bergerak pada prokariota dan eukariota: perubahan ekspresi gen, mutasi gen, penataan ulang kromosom, disgenesis hibrida. Partisipasi elemen seluler dalam organisasi struktur kromosom. Peran dalam ontogeni organisme hidup dan dalam evolusi materi genetik. Elemen bergerak sebagai alat untuk penelitian genetik.

rekombinasi ilegal. Rentang fenomena yang terkait dengan rekombinasi ilegal. Rekombinasi nonhomolog pada bakteri yang dikatalisis oleh DNA girase. Model molekul (Ikeda). Rekombinasi non-homolog yang melibatkan protein kinase yang bergantung pada DNA pada vertebrata. Berperan dalam perbaikan pemutusan untai ganda, integrasi DNA eksogen ke dalam kromosom, dan penataan ulang urutan DNA imunoglobulin.

Penataan ulang rekombinasi terprogram dari materi genetik dalam ontogeni

Penggabungan bagian-bagian gen yang terputus menggunakan rekombinasi spesifik lokasi selama sporulasi di Bacillus subtilis dan selama pembentukan heterokista di cyanobacteria berfilamen. Penataan ulang materi genetik selama pembentukan makronukleus pada ciliata bersilia. Pengurangan kromatin di sejumlah perwakilan invertebrata.

Rekombinasi situs-spesifik pada vertebrata yang terlibat dalam penataan ulang urutan DNA imunoglobulin. Struktur molekul imunoglobulin. Organisasi dan struktur sekuens DNA terlibat dalam pembentukan gen yang mengkode imunoglobulin. Peran produk gen RAG1 dan RAG2. Mekanisme rekombinasi spesifik lokasi selama docking segmen pengkodean gen imunoglobulin. Partisipasi proses genetik lain dalam pembentukan gen imunoglobulin: rekombinasi homolog (persilangan mitosis ektopik, konversi mitosis ektopik), rekombinasi ilegal, hipermutagenesis, penyambungan alternatif. Batasan proses-proses ini pada tahap-tahap tertentu diferensiasi limfosit-B.

Transformasi adalah proses penyerapan oleh sel organisme dari molekul DNA bebas dari lingkungan dan menanamkannya ke dalam genom, yang mengarah pada penampilan sel tersebut dari sifat-sifat baru yang diwariskan yang menjadi ciri organisme donor DNA. Terkadang transformasi dipahami sebagai proses transfer gen horizontal, termasuk transduksi, konjugasi, dll.

Transformasi prokariota

Dalam populasi mana pun, hanya sebagian bakteri yang mampu menyerap molekul DNA dari lingkungan. Keadaan sel yang memungkinkan hal ini disebut keadaan kompetensi. Biasanya, jumlah maksimum sel kompeten diamati pada akhir fase pertumbuhan logaritmik.

Dalam keadaan kompetensi, bakteri menghasilkan protein dengan berat molekul rendah khusus (faktor kompetensi) yang mengaktifkan sintesis autolisin, endonuklease I, dan protein pengikat DNA. Autolysin sebagian menghancurkan dinding sel, yang memungkinkan DNA melewatinya, dan juga mengurangi resistensi bakteri terhadap kejutan osmotik. Dalam keadaan kompeten, intensitas metabolisme secara keseluruhan juga menurun. Dimungkinkan untuk secara artifisial membawa sel ke dalam kondisi kompetensi. Untuk ini, media dengan kandungan kalsium, cesium, ion rubidium, elektroporasi, atau sel penerima yang tinggi diganti dengan protoplas tanpa dinding sel.

Efisiensi transformasi ditentukan oleh jumlah koloni yang ditumbuhkan pada cawan Petri setelah menambahkan 1 g DNA plasmid superkoil ke dalam sel dan menyemai sel pada media nutrisi. Metode modern memungkinkan untuk mencapai efisiensi 106--109.

DNA yang diserap harus beruntai ganda (efisiensi transformasi DNA beruntai tunggal adalah urutan besarnya lebih rendah, tetapi agak meningkat dalam lingkungan asam), panjangnya setidaknya 450 pasangan basa. PH optimum untuk proses berlangsung adalah sekitar 7. Untuk beberapa bakteri (Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus), DNA yang akan diserap harus mengandung urutan tertentu.

DNA diadsorpsi secara ireversibel pada protein pengikat DNA, setelah itu salah satu untai dipotong oleh endonuklease menjadi fragmen 2-4 ribu pasangan basa dan menembus ke dalam sel, yang kedua dihancurkan sepenuhnya. Jika fragmen ini memiliki tingkat homologi yang tinggi dengan beberapa daerah kromosom bakteri, daerah ini dapat digantikan oleh mereka. Oleh karena itu, efisiensi transformasi tergantung pada jarak evolusioner antara donor dan penerima. Total waktu proses tidak lebih dari beberapa menit. Selanjutnya, saat membagi, menjadi satu sel anak perempuan DNA, dibangun berdasarkan untai DNA asli, masuk ke yang lain - berdasarkan untaian dengan fragmen asing yang disertakan (pembelahan)

Transformasi sel eukariotik menggunakan kation polimer sintetik

Pengiriman asam nukleat asing ke dalam sel utuh, atau transformasi mendasari banyak metode rekayasa genetika. Transportasi gen fungsional ke dalam jaringan dapat memungkinkan untuk memperbaiki kekurangan gen dan mutasi yang mengakibatkan patologi herediter yang parah atau tumor kanker. Saat ini, sejumlah teknik telah dikembangkan untuk memasukkan DNA ke dalam sel, di antaranya yang paling umum adalah pengendapan dengan kalsium fosfat atau dietilaminoetil-dekstran (DEAE-dekstran), elektroporasi, injeksi mikro, penyisipan DNA ke dalam cangkang virus atau liposom yang direkonstruksi ( vesikel lipid membran buatan).

Terlepas dari keragaman metode ini, pencarian cara baru untuk mengubah sel pro dan eukariotik terus berlanjut. Di satu sisi, ini karena kebutuhan untuk meningkatkan efisiensi transformasi, di sisi lain, metode yang tercantum di atas hanya berlaku untuk sejumlah garis sel yang terbatas dan tidak efektif ketika mencoba memasukkan RNA ke dalam sel. Akhirnya, sebagian besar pendekatan ini tidak dapat digunakan untuk transformasi genetik dalam hidup.

Vektor retroviral, vektor berdasarkan virus yang mengandung DNA dan HIV, liposom berdasarkan lipid kationik, dan kation pengikat DNA polimer digunakan sebagai pembawa DNA. Penggunaan polimer sintetik sebagai pembawa DNA memiliki sejumlah keuntungan: kemudahan penyimpanan dan pemurnian, kemudahan pengujian toksisitas dan keamanan, dan, yang sangat penting untuk terapi gen, pengurangan risiko komplikasi patogenetik dan imunologis.

Ketika larutan polikation linier dan DNA dicampur, kompleks interpolielektrolit (IPECs) terbentuk karena pembentukan sistem kooperatif ikatan elektrostatik antarrantai. Dalam hal ini, rantai polikationik mengelilingi molekul DNA, membentuk bola atau toroid, tergantung pada jenis polimernya. Inklusi dalam IPEC mengarah pada pemadatan DNA, peningkatan ketahanannya terhadap aksi nuklease, meningkatkan interaksinya dengan membran sel dan meningkatkan aktivitas transformasi dalam kaitannya dengan sel prokariotik dan eukariotik. Dengan menggabungkan molekul polikation dengan ligan yang mampu mengikat spesifik pada membran sel, dimungkinkan untuk memastikan penetrasi IPEC ke dalam sel melalui jalur reseptor, dan dalam tubuh - pengiriman yang ditargetkan ke sel target.

Sistem penghantaran DNA untuk digunakan dalam terapi gen harus memastikan penetrasi DNA ke dalam organ, jaringan, atau kelompok sel tertentu yang diinginkan, dan kemudian ke dalam inti sel. Oligonukleotida antisense, yaitu yang paling sering digunakan dalam terapi gen, harus menemukan mRNA atau wilayah DNA kromosom yang menjadi sasarannya. Gen yang diperkenalkan harus dimasukkan ke dalam konstruksi yang mampu mengekspresikannya.

Namun, ini adalah masalah yang agak sulit. Ketika asam nukleat atau oligonukleotida dimasukkan ke dalam tubuh, mereka tidak akan secara dominan sampai ke jaringan atau organ yang diinginkan, dan bagian dari mereka yang akan berada di tempat yang tepat hanya akan sebagian kecil dapat melewati sel hidrofobik. selaput. Selain itu, dalam perjalanan evolusi, mekanisme telah dikembangkan untuk melindungi sel-sel tubuh dari invasi faktor lingkungan luar termasuk DNA asing. Begitu berada di dalam sel, DNA asing mungkin tidak terlokalisasi di tempat yang dibutuhkan dan, terlebih lagi, mungkin berakhir di lisosom, di mana ia akan dihancurkan oleh nuklease.

Penetrasi ke dalam sel dan transpor intraseluler IPEC terjadi, mungkin, karena pembentukan dan penghancuran endosom selanjutnya. Pada setiap tahap proses ini, sebagian besar materi hilang. Pelepasan vektor yang buruk dari endosom ke dalam sitoplasma dan transfernya yang tidak efisien ke nukleus menyebabkan rendahnya efisiensi ekspresi transgen.

Peta restriksi plasmid pBR 322:

angka menunjukkan penomoran nukleotida;

tanda hubung tipis - situs tunggal yang dikenali oleh pembatasan;

panah abu-abu tebal di atas - arah transkripsi;

Pbla - promotor gen Ampr - resistensi terhadap ampisilin;

Ptet - promotor gen Tetr - resistensi terhadap tetrasiklin;

TT1 - terminator transkripsi Rho-independen (posisi 3140-3160); TT2 - posisi 3080-3110; ROP - protein yang mendorong pembentukan dupleks antara RNA 1 dan RNA 2 (pengatur nomor salinan negatif); RNA 1 - RNA kontrol (mengontrol nomor salinan plasmid); RNA 2 - RNA "primer" (berfungsi sebagai primer untuk replikasi); panah hitam tebal - arah transkripsi RNA 1 dan RNA 2

Vektor berdasarkan fag M13

Ada tiga cara untuk meningkatkan efisiensi transfer DNA ke dalam sel eukariotik menggunakan polikation sintetik. Pertama, ini adalah peningkatan spesifisitas transfeksi karena ligan terikat pada molekul polikation dan memberikan interaksi selektif kompleks dengan sel-sel fenotipe tertentu. Kedua, meningkatkan efisiensi transformasi karena pemilihan gen atau oligonukleotida yang dimasukkan ke dalam sel. Ketiga, peningkatan frekuensi transfeksi, yang dicapai melalui penggunaan ligan yang berinteraksi lebih efektif dengan membran sel dan zat yang mengganggu kestabilan membran. Selain itu, sintesis polikation baru dimungkinkan.

Laboratorium Virologi Molekuler dan Rekayasa Genetik dari Institut Penelitian Influenza dari Akademi Ilmu Kedokteran Rusia di St. Petersburg sedang mempelajari cara mengirimkan DNA dan partikel virus ke dalam sel. Dalam karya ini, kami menggunakan satu set pendukung polimer yang disintesis oleh staf Institut Senyawa Makromolekul dari Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia. Plasmid berikut digunakan sebagai vektor ekspresi: pUC 18, mengandung promotor sitomegalovirus dan gen b-galaktosidase, dan pBR 322, mengandung promotor sitomegalovirus dan gen protein fluoresen hijau alga.

Sebagai hasil dari penelitian, ditemukan bahwa IPEC poli-(2-(dimetilamino)etil)metakrilat (PDMAEMA) dengan berat molekul rendah memiliki aktivitas transfeksi tertinggi. Penelitian lebih lanjut akan memungkinkan pengembangan pendekatan baru untuk memecahkan masalah mendesak dalam virologi, molekuler dan sel biologi, rekayasa genetika, terapi gen.

Transduksi (dari bahasa Latin transductio - gerakan) adalah proses pemindahan DNA bakteri dari satu sel ke sel lain oleh bakteriofag. Transduksi umum digunakan dalam genetika bakteri untuk pemetaan genom dan rekayasa regangan. Baik fag sedang dan fag virulen mampu melakukan transduksi; namun, fag yang terakhir menghancurkan populasi bakteri; oleh karena itu, transduksi dengan bantuan mereka tidak terlalu penting baik di alam maupun dalam penelitian.

Transduksi umum (non-spesifik)

Ini dilakukan oleh fag P1, yang ada di sel bakteri dalam bentuk plasmid, dan oleh fag P22 dan Mu, yang berintegrasi ke bagian mana pun dari kromosom bakteri. Setelah induksi profag, dengan probabilitas 10-5 per sel, pengemasan fragmen DNA bakteri yang salah ke dalam kapsid fag dimungkinkan; dalam hal ini, tidak ada DNA fag di dalamnya. Panjang fragmen ini sama dengan panjang DNA fag normal; asalnya dapat berupa: wilayah acak kromosom, plasmid, fag beriklim sedang lainnya.

Begitu berada di sel bakteri lain, sebuah fragmen DNA dapat dimasukkan ke dalam genomnya, biasanya dengan rekombinasi homolog. Plasmid yang ditransfer oleh fag dapat menutup menjadi cincin dan bereplikasi di kandang baru. Dalam beberapa kasus, sebuah fragmen DNA tidak berintegrasi ke dalam kromosom penerima, tidak bereplikasi, tetapi tetap berada di dalam sel dan ditranskripsi. Fenomena ini disebut transduksi abortif.

Transduksi spesifik

Transduksi spesifik paling baik dipelajari pada contoh fag L. Fag ini berintegrasi hanya ke dalam satu wilayah (situs att) dari kromosom E. coli dengan urutan nukleotida tertentu (homolog dengan wilayah att dalam DNA fag). Selama induksi, pengecualiannya mungkin gagal dengan kesalahan (probabilitas 10?3--10?5 per sel): sebuah fragmen dengan ukuran yang sama dengan DNA fag dipotong, tetapi dengan permulaan di tempat yang salah. Dalam hal ini, beberapa gen fag hilang, dan beberapa gen E. coli ditangkap olehnya. Probabilitas transfer gen dalam kasus ini berkurang dengan meningkatnya jarak dari itu ke situs att.

Setiap fag beriklim sedang yang secara khusus berintegrasi ke dalam kromosom memiliki situs attnya sendiri dan, oleh karena itu, gen yang terletak di sebelahnya, yang dapat ditransmisikannya. Sejumlah fag dapat berintegrasi ke tempat mana pun pada kromosom dan membawa gen apa pun melalui mekanisme transduksi spesifik. Selain itu, kromosom biasanya mengandung sekuens yang sebagian homolog dengan daerah att DNA fag. Jika situs att yang sepenuhnya homolog rusak, adalah mungkin untuk mencapai inklusi fag ke dalam kromosom sesuai dengan urutan ini dan transfer gen yang berdekatan dengannya selama transduksi spesifik.

Ketika fag sedang yang membawa gen bakteri diintegrasikan ke dalam kromosom bakteri inang baru, fag itu sudah mengandung dua gen identik - miliknya sendiri dan dibawa dari luar. Karena fag kehilangan beberapa gennya sendiri, fag sering tidak dapat diinduksi dan bereproduksi. Namun, ketika sel yang sama terinfeksi dengan fag "tambahan" dari spesies yang sama, induksi fag yang rusak menjadi mungkin. Baik DNA dari fag "tambahan" normal dan DNA dari fag yang rusak, bersama dengan gen bakteri yang mereka bawa, keluar dari kromosom dan bereplikasi. Oleh karena itu, sekitar 50% partikel fag yang dihasilkan membawa DNA bakteri. Fenomena ini disebut transduksi frekuensi tinggi (HFT).

Konjugasi (dari bahasa Latin conjugatio - koneksi), proses paraseksual - transfer searah dari bagian materi genetik (plasmid, kromosom bakteri) dengan kontak langsung dua sel bakteri. Dibuka pada tahun 1946 oleh J. Lederberg dan E. Taitem. Ini sangat penting di alam, karena mempromosikan pertukaran sifat-sifat yang berguna tanpa adanya proses seksual yang benar. Dari semua proses transfer gen horizontal, konjugasi memungkinkan transfer informasi genetik dalam jumlah terbesar.

Mekanisme

Agar berhasil menjalin kontak antara dua sel, plasmid konjugatif (seksual, dapat ditularkan) harus ada dalam sel donor. Yang pertama adalah plasmid F: episom (mampu berintegrasi ke dalam kromosom bakteri), panjangnya sekitar 100 ribu pasangan basa. Plasmid membawa gen yang mengkode sejumlah fungsi. Salah satunya adalah pembentukan pili seks yang bertanggung jawab untuk perlekatan pada sel penerima.

Plasmid konjugatif juga mengkode protein yang mencegah pelekatan pili bakteri lain ke dinding sel yang satu ini. Oleh karena itu, sel-sel yang sudah mengandung plasmid yang dapat ditransmisikan beberapa kali lebih kecil kemungkinannya untuk bertindak sebagai penerima selama konjugasi.

Plasmid mengkodekan endonuklease yang memotong salah satu untai DNA pada titik tertentu (oriT). Kemudian rantai yang dipotong dilepaskan dan ujung 5" dipindahkan ke sel penerima. Diduga bahwa DNA ditransmisikan melalui saluran di pili seks, tetapi sejauh ini telah ditunjukkan bahwa transfer terjadi melalui pori-pori di dalam sel. Di segmen pertama filamen yang memasuki DNA sel penerima terletak gen antirestriksi.Gen-gen ini harus ditranskripsikan di penerima segera setelah mereka tiba di sana untuk memastikan akumulasi protein yang menghalangi proses penghancuran DNA oleh enzim restriksi .Akhirnya, rantai yang ditransfer menutup menjadi sebuah cincin dan atas dasar struktur untai ganda DNA plasmid dipulihkan. Seluruh proses memakan waktu beberapa menit.

Plasmid konjugatif dapat diintegrasikan ke dalam kromosom melalui rekombinasi homolog yang melibatkan elemen IS. Konjugasi dalam hal ini berlangsung sesuai dengan mekanisme yang sama, namun, tidak hanya plasmid yang ditransfer ke penerima, tetapi juga materi kromosom donor. Dalam hal ini, prosesnya tertunda selama berjam-jam, seringkali terjadi pemutusan pada untai DNA yang ditransmisikan. Dengan menghentikan transfer DNA secara artifisial pada waktu yang berbeda dan mengamati gen mana yang ditransfer, peta kromosom E. coli diperoleh dan struktur cincinnya ditunjukkan.

Ketika dibelah dari kromosom, plasmid dapat menangkap fragmennya dan mentransfernya ke sel lain (analogi dengan transduksi). Proses ini disebut sexduction.

Beberapa plasmid kecil, yang disebut mobilizable, dapat ditransfer melalui konjugasi menggunakan alat transfer plasmid transfer "pembantu". Untuk melakukan ini, mereka harus mengandung urutan yang mirip dengan asal plasmid konjugatif dan dikenali oleh endonukleasenya.