Struktur apa yang dikandung E. coli. Strain baru E. coli ternyata merupakan hibrida “supertoksik”. Strain Escherichia coli - probiotik dan komponen obat
Menguraikan genom EHEC menunjukkan bahwa infeksi usus yang melanda Eropa disebabkan oleh strain bakteri yang sebelumnya tidak terlihat - "sangat menular dan beracun." Jumlah yang terinfeksi tidak berkurang, dua kasus penyakit telah diidentifikasi di Amerika Serikat, semua jejak mengarah ke utara Jerman, sumber infeksi belum ditemukan. Petani Spanyol yang direhabilitasi menuntut kompensasi, kerugian mengancam seluruh UE: Rusia telah melarang impor sayuran dari Eropa. Moskow membuat gajah keluar dari lalat, orang Eropa marah.
Strain E. coli yang telah menimbulkan kekhawatiran di seluruh Eropa adalah jenis bakteri "super-beracun" yang sebelumnya tidak diketahui, The New York Times melaporkan, mengutip pejabat dan ahli pada hari Kamis.
"Sepengetahuan kami, jenis ini belum pernah terdeteksi dalam wabah sebelumnya," kata Gregory Hartl, juru bicara WHO. Kasus penyakit ini telah dilaporkan sejauh ini oleh 10 negara, tetapi hampir semua jejak mengarah ke utara Jerman, tulis surat kabar itu.
Infeksi ini disebabkan oleh "jenis bakteri baru yang sangat menular dan beracun," kata Institut Genomics Beijing, yang bekerja sama dengan ilmuwan Jerman dari Universitas China, dalam sebuah pernyataan. Pusat layanan kesehatan Hamburg-Eppendorf. Para peneliti Cina menyimpulkan bahwa jenis baru ini mirip dengan bakteri EAEC 55989, yang ditemukan di Republik Afrika Tengah dan menyebabkan diare parah.
“Situasi masih tegang. Pada awal minggu, kami berharap jumlah orang yang terinfeksi akan mulai berkurang, tetapi ini tidak terjadi, ”kata Jörg Debatin, direktur pusat Hamburg-Eppendorf. Menurut rekannya, ahli bakteriologi Holger Rohde, laboratorium Cina menyimpulkan bahwa strain baru adalah hibrida dan menghasilkan komplikasi akut yang berpotensi fatal yang disebut sindrom uremik hemolitik. “Gen dari galur baru sekitar 80% identik dengan galur O104, dan 20% sisanya kembali ke bakteri lain yang lebih beracun,” surat kabar itu menceritakan kembali kata-kata Rode. Sebelumnya, Pusat Pencegahan dan Pengendalian Penyakit Eropa (ECDC) dan badan-badan Eropa lainnya mengatakan wabah itu disebabkan oleh jenis E. coli yang langka, O104:H4.
Menurut WHO, Swedia melaporkan 28 kasus, Denmark - 7, Prancis - 6, dll. Hampir semua dari orang-orang ini baru-baru ini mengunjungi utara Jerman, dan salah satunya memiliki kontak dengan pengunjung dari sana.
Wabah semakin mempengaruhi kehidupan politik Eropa dan hubungan ekonominya, tulis surat kabar itu. Jadi, jika Rusia secara ketat mengamati embargo impor sayuran, petani Eropa akan menemukan diri mereka dalam situasi yang lebih sulit, kehilangan salah satu pasar penjualan terbesar.
”Dalam mencari cara yang efektif untuk melawan infeksi usus yang berbahaya, para dokter telah mengambil langkah maju yang penting,” lapor Frankfurter Allgemeine Zeitung dari Jerman. “Sekarang genom EHEC telah diuraikan, dan para ahli mencari kerentanan musuh mereka.” Di Jerman, sementara itu, infeksi terus mengamuk - 17 orang telah meninggal karena konsekuensinya. Secara total, sekitar 2 ribu kasus EHEC strain E. coli telah tercatat di Jerman. Menurut WHO, kasus penyakit ini telah terdaftar di sepuluh negara Eropa.
Para ahli dari Rumah Sakit Universitas Hamburg-Eppendorf, bekerja sama dengan rekan-rekan Cina, menguraikan genom bakteri, menetapkan bahwa kita sedang berbicara tentang hibrida enterobacteria yang sebelumnya tidak terlihat menyebabkan apa yang disebut sindrom hemolitik-uremik.
Sementara itu, artikel tersebut mengatakan, Spanyol sedang mencari jutaan dolar sebagai kompensasi atas kerusakan yang disebabkan oleh pertaniannya sebagai akibat dari deklarasi Jerman yang tergesa-gesa.
Sementara itu, setidaknya dua kasus infeksi E. coli telah diidentifikasi di AS, menurut The Washington Post. Kedua kasus dirawat di rumah sakit pada Mei dengan sindrom mikroba serius setelah kembali dari Hamburg, di mana mereka diyakini telah terinfeksi. Pejabat sedang menunggu hasil laboratorium untuk mengkonfirmasi diagnosis.
"Donald Cramer, wakil kepala divisi pengawasan makanan FDA, mengatakan bahwa badan tersebut sedang mencari produk yang berasal dari Spanyol dan negara-negara lain di mana penyakit itu telah menyebar," tulis penulis Lindsey Layton.
Philip Tarr, seorang spesialis E. coli di Universitas Washington di departemen kedokteran St. Louis, percaya bahwa wabah itu tidak mungkin mencapai Amerika Serikat karena bakteri itu tidak ditemukan dalam makanan yang dipasok ke pasar Amerika. Meskipun dapat menyebar dari orang ke orang, lebih sering disebabkan oleh makanan yang terkontaminasi.
Namun, jika bakteri yang membunuh 18 orang di Eropa menginfeksi buah dan sayuran yang ditanam di Amerika Serikat, tidak mungkin mencegah wabah karena produsen Amerika tidak diharuskan menguji makanan untuk patogen ini sebelum mereka memasuki supermarket. Menurut para ahli, kerangka peraturan Amerika dalam hal ini adalah "beberapa langkah di belakang." Pada saat yang sama, regulator AS berfokus terutama pada versi E. coli yang lebih terkenal, E. coli 0157. Strain yang telah menginfeksi lebih dari 1.600 orang di Eropa adalah versi mikroorganisme yang sangat berbahaya, E. coli 0104 , tulis surat kabar itu.
Karena takut E. coli, Rusia telah melarang impor sayuran dari UE, kata The Financial Times. Kepala Rospotrebnadzor Gennady Onishchenko mengatakan larangan itu segera berlaku dan petugas bea cukai telah diperintahkan untuk memblokir impor, terutama dari Jerman dan Spanyol.
Menurut Freshfel, Rusia merupakan pasar ekspor terbesar bagi produsen sayuran Eropa. 34% sayuran yang diimpor ke Rusia adalah Eropa, terutama dari Polandia dan Belanda.
Kepala Komisi Eropa untuk Kesehatan dan Perlindungan Konsumen, Paola Testori Cogi, menulis dalam menanggapi Onishchenko "surat dengan kata-kata kasar", menyerukan penghapusan "pembatasan yang tidak masuk akal." “Saya menganggap tindakan seperti itu tidak proporsional, tidak masuk akal secara ilmiah, dan karena itu tidak sejalan dengan prinsip-prinsip perjanjian [perdagangan] [internasional],” katanya dalam sebuah surat.
Keputusan Kremlin adalah tanda bahwa wabah berisiko menyebabkan kepanikan massal, catat surat kabar itu. Para ahli Eropa belum mengidentifikasi sumber E.coli.
Ini bukan pertama kalinya Rusia membuat keputusan sulit seperti itu, El Mundo mencatat, mengingat krisis gas tahun 2009, ketika Moskow menekan Eropa ke tembok. Kali ini, menurut Ian Begg, seorang profesor di Institut Eropa di London School of Economics (LSE), Rusia telah menunjukkan "reaksi naluriah yang lebih populis daripada berbasis ilmiah." Mungkin ini tentang harapan mendapatkan dividen dalam pemilihan mendatang atau kebiasaan Rusia membuat gajah keluar dari lalat, tetapi argumen Rusia tidak tahu setengah nada, tulis surat kabar itu.
Komisi Eropa mengutuk reaksi berlebihan Rusia, memperingatkan bahwa itu akan membutuhkan penjelasan, tetapi semua peringatan ini bisa tetap berupa kata-kata, terlepas dari konsekuensi ekonomi yang mengerikan dari blokade semacam itu. “Mengingat Rusia bukan anggota WTO, dan kami perlu mengimpor gasnya, tindakan pembalasan akan sulit,” kata Begg.
Genetika melakukan penelitian ilmiah di bidang bioteknologi mikroba dan kultur sel terutama dalam bentuk proyek penelitian yang diminta oleh industri. Hasil kami tersedia sebagai paten, lisensi, dan pengetahuan. Sejak didirikan (1968) Genetika telah menjadi salah satu pusat penelitian Rusia yang paling signifikan dalam genetika mikroba dan biologi molekuler dan pada saat yang sama berfungsi sebagai sumber utama galur dan proses baru untuk industri bioteknologi Rusia.
Teknologi yang dikembangkan di Genetika (treonin - 1979, riboflavin - 1991, akrilamida - 2000, fitase - 2008) digunakan di seluruh dunia oleh perusahaan bioteknologi terkemuka. Penelitian dasar yang diberikan pemerintah serta kolaborasi dengan organisasi penelitian Rusia dan internasional lainnya membantu menjembatani kesenjangan antara penelitian terapan dan dasar. Berbagai proyek penelitian interdisipliner mendorong perkembangan inovatif ke depan. Sekarang Genetika siap untuk mengejar implementasi penelitian inovatif dalam aplikasi industri dan sosial di seluruh dunia.more
|
Artikel baru di CELL oleh peneliti Genetika Alex Mironov dan Svetlana Eremina. Bakteri Oksida Nitrat Memperpanjang Umur C. elegans (unduh artikel) Ivan Gusarov, Laurent Gautier, Olga Smolentseva, Ilya Shamovsky, Svetlana Eremina, Alexander Mironov, Evgeny Nudler., ABSTRAK Nitric oxide (NO) merupakan molekul pemberi sinyal yang penting pada organisme multiseluler. Sebagian besar hewan menghasilkan NO dari L-arginin melalui keluarga enzim khusus yang dikenal sebagai NO sintase (NOSes). Pengecualian yang langka adalah cacing gelang Caenorhabditis elegans, yang tidak memiliki NOS-nya sendiri. Namun, di lingkungan alaminya, C. elegans memakan Basil yang memiliki NOS fungsional. Di sini, kami menunjukkan bahwa NO yang diturunkan secara bakterial meningkatkan umur panjang C. elegans dan ketahanan terhadap stres melalui kelompok gen tertentu yang berfungsi di bawah kendali ganda faktor transkripsi HSF-1 dan DAF-16. Pekerjaan kami memberikan contoh pensinyalan antarspesies oleh molekul kecil dan menggambarkan nilai seumur hidup bakteri komensal bagi inangnya. |
 |
|
Artikel ulasan baru "Penghasil Mikroba Butanol" ( Unduh artikel) O. V. Berezina, N. V. Zakharova, C. V. Yarotsky, dan V. V. Zverlov Abstrak—Tinjauan ini ditulis karena meningkatnya minat dalam produksi pembawa energi dan substrat dasar industri kimia dari sumber daya alam terbarukan. Dalam tinjauan ini, aspek mikrobiologis dari produksi biobutanol tercermin dan produsen mikroba butanol (baik alami, yaitu anggota genus Clostridium, dan rekombinan), yang diperoleh dengan modifikasi genetik Clostridia dan mikroorganisme lainnya, dicirikan. |
 |
Wabah besar infeksi E. coli tipe O104 di Eropa telah menginfeksi lebih dari 1.800 orang dan menyebabkan komplikasi yang berpotensi fatal yang dikenal sebagai sindrom uremik hemolitik pada lebih dari 500 orang.
Wabah itu melintasi perbatasan setidaknya 13 negara dan menewaskan sekitar 20 orang.
Ketika otoritas kesehatan berjuang untuk menunjukkan dengan tepat wabah dalam makanan, perhatian internasional difokuskan pada lintasan kompleks yang diikuti oleh produk pertanian di era perdagangan global.
Namun, satu aspek dari epidemi ini kurang mendapat perhatian: strain abnormal ini resisten terhadap banyak jenis antibiotik.
Di antara semua pertanyaan mendesak yang dimunculkan oleh wabah, resistensi strain ini membunyikan semua lonceng dan mendorong pertimbangan serius tentang masalah ini. membatasi penggunaan antibiotik secara berlebihan disebabkan oleh infeksi.
Resistensi strain O104 disebutkan secara sepintas, tetapi lebih sebagai titik penasaran yang membedakan infeksi ini daripada sebagai masalah.
Memiliki sangat penting karena cara paling aman untuk mengobati infeksi E.coli adalah juga menghasilkan racun seperti Escherichia coli.
Hindari penggunaan antibiotik karena ketika obat membunuh bakteri, mereka menghasilkan racun yang dapat menyebabkan gejala terburuk penyakit.
Oleh karena itu, karena antibiotik tidak dapat digunakan untuk melawan infeksi E. coli, pertanyaan apakah mereka akan bekerja telah menjadi topik yang menarik secara akademis - salah satu dari banyak perdebatan online oleh para peneliti sukarelawan yang melakukan tes cepat di seluruh dunia.
Bahkan jika tidak relevan dengan korban saat ini, resistensi antibiotik yang signifikan dari infeksi E. coli ini patut dicatat.
Ini sebagian karena toksin Shiga, yang dihasilkan oleh infeksi usus galur seperti O104:H4 dan galurnya yang jauh lebih terkenal, O157:H7, jarang terjadi.
Jika hanya karena alasan ini, perlu untuk mengembangkan metode perlindungan baru terhadap musuh yang mengerikan ini.
Lebih penting lagi, bagaimanapun, setidaknya selama satu dekade, faktor resistensi baru telah muncul di Eropa yang meningkatkan resistensi strain O104.
Pergerakan mereka ke dalam strain menunjukkan bahwa faktor resistensi dapat berkeliaran tanpa batas di antara organisme segera setelah mereka muncul.
Dan ini harus menyoroti pentingnya memperlambat perkembangan resistensi antibiotik dengan membatasi penggunaan antibiotik yang tidak tepat dalam pengobatan sehari-hari dan di pertanian.
Menurut Institut Robert Koch Jerman, strain O104 resisten terhadap lebih dari sepuluh antibiotik delapan kelas:
penisilin
streptomisin
tetrasiklin
kuinolon (asam nalidiksat)
trimetoprim/sulfametoksazol
tiga generasi sefalosporin
amoksil/asam klavulanat
piperasilin/sulbaktam
piperasilin/tazobaktam.
Resistensi terhadap sejumlah obat tersebut menunjukkan bahwa strain O104 mengandung bakteri ESBL yang resisten.
Memang, menurut analisis Institut Koch, strain mengandung dua gen yang menyebabkan resistensi ini - TEM-1 dan CTX-M-15.
Properti ini telah membuat dokter menggigil sejak tahun 1990-an, ketika strain bakteri resisten ESBL dan Klebsiella menyebabkan infeksi nosokomial serius yang melanda Eropa.
Karena mereka awalnya mempengaruhi pasien di unit perawatan intensif, jenis ini tidak menimbulkan banyak kekhawatiran di dunia.
Namun sekitar tahun 2001, faktor-faktor resisten ini menyusup ke dalam kehidupan sehari-hari dan menyebabkan kepanikan.
Karena relokasi genetik yang telah dilakukan bakteri sepanjang waktu, gen resistensi telah pindah ke beberapa strain bakteri E. coli, tidak begitu banyak dalam makanan, menciptakan racun, tetapi menyebar secara umum, menyebabkan infeksi saluran kemih dan lainnya yang biasanya ringan. penyakit.
Tiba-tiba, rumah sakit di Bermingham dan Shropshire melaporkan wabah signifikan infeksi E. coli dan ESBL, dan dokter rumah sakit saling melaporkan tentang wanita muda yang menderita infeksi kandung kemih berulang yang mungkin disebabkan oleh obat baru.
Ini bukan hanya fenomena di tahun 2000-an.
Pada bulan Maret 2010, Rumah Sakit Universitas Staffordshire Utara mencatat wabah yang disebabkan oleh bakteri ESBL dan Klebsiella, yang mengakibatkan pasien meninggal.
Dari mana faktor resistensi ini berasal?
Perkembangan resistensi adalah proses biologis yang tak terelakkan; dengan demikian, bakteri dilindungi dari komponen yang mematikan, baik komponen tersebut diproduksi oleh bakteri lain atau diproduksi secara artifisial di laboratorium penelitian.
Namun, penggunaan antibiotik yang berlebihan mempercepat proses dan membuat hasilnya tidak dapat diprediksi.
Penggunaan berlebihan ini terjadi setiap kali seseorang menggunakan antibiotik untuk penyakit yang tidak cocok untuknya, seperti pilek atau infeksi telinga.
Ini bahkan lebih sering terjadi ketika antibiotik dosis kecil ditambahkan per ton produk di kompleks agroindustri, tanpa pengamatan dan studi tentang virus yang muncul.
Studi di Spanyol dan Amerika Serikat menunjukkan hubungan antara agrokompleks dan munculnya bakteri ESBL: mereka mengidentifikasi bakteri resisten dalam daging ayam yang dijual di supermarket.
Bahkan jika peneliti mengidentifikasi sayuran yang mungkin menyebabkan wabah, mereka tidak akan pernah tahu bagaimana bakteri resisten masuk ke dalam produk.
Pada tahun 2006, AS mengalami wabah nasional infeksi usus strain O157, bakteri yang terinfeksi bayam segar.
Dan meskipun kecurigaan para peneliti jatuh pada kotoran ternak atau babi hutan di dekat peternakan, mereka tidak dapat mengidentifikasi penyebab infeksi.
Tapi kita sudah tahu mengapa resistensi antibiotik muncul dalam wabah ini, dan mengingat kecenderungan bakteri yang tidak menentu untuk bergerak. materi genetik, kita tahu bahwa strain O104 resisten karena mengandung bakteri serupa dan dapat menularkannya ke jenis infeksi lain.
Sudah saatnya bagi pemerintah dan otoritas kesehatan untuk melakukan segala daya mereka untuk memperlambat perkembangan resistensi obat, membatasi penggunaan antibiotik yang berlebihan di seluruh dunia.
Escherichia coli (E. coli) adalah bakteri Gram-negatif berbentuk batang yang umumnya ditemukan di usus bagian bawah organisme berdarah panas (endotermik). Sebagian besar galur E. coli tidak berbahaya, tetapi beberapa serotipe bersifat patogen dan dapat menyebabkan keracunan makanan yang serius pada manusia, dan kehadirannya dalam produk bahkan dapat mengakibatkan penarikan produk dari pasar. Strain yang tidak berbahaya adalah bagian dari flora normal usus dan dapat bermanfaat bagi tubuh dengan memproduksi vitamin K2 dan mencegah produksi bakteri patogen di usus.
pengantar
E. coli dan bakteri terkait membentuk sekitar 0,1% dari flora usus, dan jalur penularan fekal-oral adalah jalur utama melalui strain patogen bakteri yang menyebabkan penyakit. Sel mampu bertahan hidup di luar tubuh untuk waktu yang terbatas, menjadikannya organisme indikator yang ideal untuk menguji sampel lingkungan untuk kontaminasi tinja. Bakteri ini juga dapat tumbuh dengan mudah dan murah di laboratorium, dan telah dipelajari secara intensif selama lebih dari 60 tahun. E. coli adalah organisme model prokariotik yang paling banyak dipelajari dan juga merupakan spesies penting dalam bidang bioteknologi dan mikrobiologi, di mana ia berfungsi sebagai organisme inang untuk sebagian besar pekerjaan DNA rekombinan. Dokter anak dan ahli bakteriologi Jerman Theodor Escherich menemukan E. coli pada tahun 1885, dan sekarang diklasifikasikan sebagai bagian dari keluarga gamma-proteobacterium Enterobacteriaceae.
serotipe
Strain patogen E. coli dapat dikategorikan berdasarkan elemen yang dapat menimbulkan respon imun pada hewan, sebagai berikut: O antigen: bagian dari lapisan lipopolisakarida K antigen: kapsul H antigen: flagellin Misalnya, E. coli strain EDL933 milik golongan O157: H7 .
O antigen
Membran luar sel E. coli mengandung jutaan molekul lipopolisakarida (LPS), yang terdiri dari:
Antigen O, polimer oligosakarida berulang yang imunogenik (1-40 unit)
Wilayah utama oligosakarida tidak berulang terfosforilasi
Lipid A (endotoksin)
Antigen O digunakan untuk serotipe E. coli dan penunjukan grup O ini dimulai dari O1 hingga O181, kecuali untuk beberapa grup yang secara historis telah dihapus, yaitu O31, O47, O72, O67, O93 (sekarang K84), O94 dan O122; kelompok 174 hingga 181 adalah awal (O174 = OX3 dan O175 = OX7) atau sedang dipelajari (176 hingga 181 - STEC/VTEC). Selain itu, ada subtipe untuk banyak grup O (misalnya, O128ab dan O128ac). Namun perlu dicatat bahwa antibodi terhadap beberapa antigen O bereaksi silang dengan antigen O lainnya dan sebagian dengan antigen K tidak hanya dari E. coli, tetapi juga dari spesies bakteri Escherichia lainnya dan spesies Enterobacteriaceae. Antigen O dikodekan oleh kluster gen rfb. Gen peran (cld) mengkodekan pengatur panjang rantai-O lipopolisakarida.
antigen K
Polisakarida kapsular asam (ACP) adalah lapisan polisakarida berlendir tebal yang mengelilingi beberapa patogen E. coli. Ada dua kelompok terpisah dari kelompok antigen K, yang disebut kelompok I dan kelompok II (sementara kelompok perantara kecil (K3, K10 dan K54/K96) telah diklasifikasikan sebagai kelompok III). Kelompok pertama (I) terdiri dari 100 kDa (besar) polisakarida kapsuler, dan yang kedua (II) berhubungan dengan penyakit ekstraintestinal dan kurang dari 50 kDa. Kelompok antigen IK hanya ditemukan dengan antigen O tertentu (kelompok O8, O9, O20 dan O101), mereka dibagi lagi berdasarkan tidak adanya (IA, mirip dengan spesies Klebsiella dalam struktur) atau adanya (IB) gula amino dan beberapa antigen kelompok IK melekat pada inti lipid A dari lipopolisakarida (KLPS), mirip dengan antigen O (dan, secara struktural identik dengan antigen O, dalam beberapa kasus hanya dianggap sebagai antigen K ketika diekspresikan bersama dengan antigen O sejati lainnya). Antigen kelompok II K menyerupai bakteri Gram-positif dan sangat bervariasi dalam komposisi dan dibagi lagi menurut komponen asamnya. Sebagai aturan, 20-50% dari rantai CPS dikaitkan dengan fosfolipid. Secara total, ada 60 antigen K berbeda yang telah dikenali (K1, K2A/AC, K3, K4, K5, K6, K7 (= K56), K8, K9 (= O104), K10, K11, K12 (K82 ) , K13 (= K20 dan = K23), K14, K15, K16, K18a, K18ab (= K22), K19, K24, K26, K27, K28, K29, K30, K31, K34, K37, K39, K40, K41 , K42 , K43, K44, K45, K46, K47, K49 (o46), K50, K51, K52, K53, K54 (= K96), K55, K74, K84, K85ab/acre (= O141), K87 (= O32 ) , K92, K93, K95, K97, K98, K100, K101, K102, K103, KX104, KX105, dan KX106).
antigen H
Antigen H adalah komponen flagela utama yang terlibat dalam pergerakan E. coli. Biasanya dikodekan oleh gen FLIC. Terdapat 53 antigen H yang teridentifikasi, diberi nomor dari H1 hingga H56 (H13 dan H22 bukan antigen E. coli tetapi termasuk dalam kelompok Citrobacter freundii dan H50 ditemukan sama dengan H10).
Peran dalam perkembangan penyakit
Pada manusia dan hewan peliharaan, strain E. coli yang mematikan dapat menyebabkan berbagai penyakit. Pada manusia: gastroenteritis, infeksi saluran kemih, dan meningitis neonatus. Lebih jarang, strain virulen juga dapat menyebabkan sindrom uremik hemolitik, peritonitis, mastitis, septikemia, dan pneumonia gram negatif.
Infeksi saluran cerna
Setiap bakteri individu adalah silinder bulat. Beberapa galur E. coli, seperti O157:H7, O104:H4, O121, O26, O103, O111, O145, dan O104:H21, menghasilkan racun yang berpotensi mematikan. Keracunan makanan, disebabkan oleh E. coli, dapat disebabkan oleh makan sayuran yang tidak dicuci atau daging yang tidak disembelih dan dimasak dengan buruk. O157: H7 juga terkenal karena menyebabkan komplikasi serius dan bahkan mengancam jiwa seperti sindrom uremik hemolitik. Strain ini dikaitkan dengan wabah E. coli 2006 di AS karena bayam segar. O104: Strain H4 sama ganasnya. Perawatan antibiotik dan protokol perawatan suportif tidak dikembangkan dengan baik untuk melawannya (bisa sangat enterohemoragik, seperti O157:H7, menyebabkan diare berdarah, tetapi juga lebih enteroaggregatif, yaitu melekat dengan baik dan melekat pada membran usus). Strain ini bertanggung jawab atas wabah mematikan E. coli di Eropa pada Juni 2011. Tingkat keparahan penyakit sangat bervariasi; ini dapat menyebabkan hasil yang mematikan, terutama pada anak kecil, orang tua, atau mereka yang mengalami imunosupresi, tetapi cenderung lebih ringan. Sebelumnya, pada tahun 1996, kebersihan yang buruk dalam persiapan daging di Skotlandia menyebabkan tujuh kematian akibat keracunan E. coli, dan ratusan orang terinfeksi. E. coli dapat menampung enterotoksin yang tahan panas dan labil terhadap panas. Yang terakhir, yang disebut LT, mengandung satu subunit A dan lima subunit B yang terletak di holotoxin tunggal dan sangat mirip dalam struktur dan fungsinya dengan racun kolera. Subunit B memfasilitasi perlekatan dan masuknya toksin ke dalam sel inang usus, sedangkan subunit A dipecah dan mencegah sel mengambil air, menyebabkan diare. LT disekresikan selama jalur sekresi tipe 2. Jika E. coli keluar dari saluran pencernaan melalui perforasi (misalnya, dari ulkus, usus buntu yang pecah, atau karena kesalahan pembedahan) dan masuk ke perut, mereka biasanya menyebabkan peritonitis, yang dapat berakibat fatal jika tidak diobati. Namun, E. coli sangat sensitif terhadap antibiotik seperti streptomisin atau gentamisin. Studi terbaru menunjukkan bahwa pengobatan antibiotik enteropathogenic E. coli mungkin tidak meningkatkan hasil penyakit, karena secara signifikan dapat meningkatkan kemungkinan mengembangkan sindrom hemolitik-uremik. E. coli di mukosa usus diamati dalam jumlah yang meningkat pada penyakit radang usus, penyakit Crohn dan kolitis ulserativa. Sejumlah besar strain invasif E. coli ada dalam jumlah besar di jaringan yang meradang, dan jumlah bakteri di daerah yang meradang berkorelasi dengan tingkat keparahan peradangan usus. Infeksi gastrointestinal dapat menyebabkan perkembangan sel T memori, yang menyerang mikroba usus di saluran usus. Keracunan makanan dapat memicu respons imun terhadap bakteri mikroba usus. Beberapa peneliti menyarankan bahwa ini dapat menyebabkan penyakit radang usus.
Keracunan
E. coli (EC) diklasifikasikan berdasarkan karakteristik serologis dan sifat virulensinya. Virotipe meliputi: Escherichia coli enterotoksigenik(ETEC) adalah agen penyebab diare (tanpa demam) pada manusia, babi, domba, kambing, sapi, anjing dan kuda. ETEC menggunakan adhesins fimbrial (proyeksi dari permukaan sel bakteri) untuk mengikat sel-sel enterosit di usus kecil. ETEC dapat menghasilkan dua protein enterotoksin: Yang lebih besar dari dua protein, LT enterotoksin, serupa struktur dan fungsinya dengan toksin kolera. Protein yang lebih kecil, ST enterotoksin, menyebabkan akumulasi cGMP di sel target dan selanjutnya sekresi cairan dan elektrolit ke dalam lumen usus. Strain ETEC bersifat non-invasif dan tidak meninggalkan lumen usus. ETEC adalah bakteri penyebab diare pada anak-anak di negara berkembang dan juga penyebab paling umum dari diare perjalanan. Setiap tahun, ETEC menyebabkan lebih dari 200 juta kasus diare dan 380.000 kematian, sebagian besar pada anak-anak di negara berkembang. Escherichia coli enteropatogenik (EPEC) adalah agen penyebab diare pada manusia, kelinci, anjing, kucing dan kuda. Seperti ETEC, EPEC juga menyebabkan diare, tetapi mekanisme molekuler kolonisasi dan etiologinya berbeda. EPEC tidak memiliki toksin ST dan LT, tetapi menggunakan adhesin yang dikenal sebagai intimin untuk mengikat sel-sel usus inang. Virulensi ini memiliki banyak faktor virulensi yang mirip dengan Shigella dan mungkin memiliki toksin Shiga. Pengikatan pada mukosa usus menyebabkan penataan ulang aktin di sel inang, yang menyebabkan deformitas yang signifikan. Sel EPEC cukup invasif (yaitu menyerang sel inang) dan menyebabkan respon inflamasi. Perubahan ultrastruktur sel usus karena "penambatan dan perataan" kemungkinan besar merupakan penyebab utama diare pada mereka yang menderita EPEC. Escherichia coli enteroinvasif (EIEC) hanya ditemukan pada manusia. Infeksi EIEC menyebabkan sindrom yang identik dengan disentri, dengan diare yang banyak dan demam tinggi. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) ditemukan pada manusia, sapi dan kambing. Anggota paling terkenal dari virotipe ini adalah galur O157:H7, yang menyebabkan diare berdarah tanpa demam. EHEC dapat menyebabkan sindrom uremik hemolitik dan serangan mendadak gagal ginjal. Ini menggunakan fimbriae bakteri untuk perlekatan (umum E. coli pilus, ECP), cukup invasif, dan memiliki toksin Shiga yang dikodekan fag yang dapat menginduksi respons inflamasi yang intens. Enteroaggregant E. coli (EAEU) hanya ditemukan dalam tubuh manusia, dinamakan demikian karena memiliki pili yang mengumpulkan sel-sel kultur jaringan. EAEC mengikat mukosa usus, menyebabkan diare berair tanpa demam. EAEC bersifat non-invasif. Mereka menghasilkan hemolisin dan ST enterotoksin, mirip dengan ETEC. E. coli invasif perekat (AIEC) ditemukan dalam tubuh manusia. AIECs mampu menyerang sel epitel usus dan berkembang biak secara intraseluler. Kemungkinan AIECs mampu berkembang biak lebih efisien pada organisme dengan kekebalan bawaan yang rusak. Mereka berhubungan dengan mukosa usus pada penyakit Crohn.
Epidemiologi Infeksi Gastrointestinal
Penularan E. coli patogen sering terjadi melalui rute fekal-oral. Rute transmisi umum meliputi: Persiapan makanan yang tidak higienis, polusi kotoran ternak, irigasi tanaman dengan air yang tercemar atau kotor dari yang tidak diolah air limbah, keberadaan babi liar di tanah yang subur, atau konsumsi langsung air limbah yang tercemar. Susu dan besar ternak adalah reservoir utama E. coli O157:H7 dan mereka dapat membawanya tanpa gejala dan menyebarkannya melalui kotoran mereka. Makanan yang terkait dengan wabah E. coli termasuk mentimun, daging cincang mentah, kecambah atau bayam mentah, susu mentah, jus yang tidak dipasteurisasi, keju yang tidak dipasteurisasi, dan makanan yang terkontaminasi oleh pekerja yang terinfeksi. Industri makanan melalui rute fekal-oral. Menurut Food and Drug Administration AS, siklus penularan fecal-oral dapat terganggu oleh persiapan makanan yang tepat, pencegahan kontaminasi silang, penggunaan penghalang seperti sarung tangan untuk pekerja makanan, kebijakan kesehatan masyarakat, perhatian medis yang dicari oleh pekerja makanan jika mereka sakit, pasteurisasi jus atau produk susu dan persyaratan mencuci tangan yang sesuai. Shiga penghasil toksin E. coli (STEC), khususnya serotipe O157:H7, juga telah ditularkan melalui lalat, serta melalui kontak langsung dengan hewan ternak, hewan kebun binatang mini, dan partikel udara di lingkungan penahanan hewan.
Infeksi saluran kemih
Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) bertanggung jawab atas sekitar 90% infeksi saluran kemih (ISK) yang terlihat pada orang dengan anatomi normal. Pada infeksi asenden, bakteri fekal menjajah uretra dan menyebar dari saluran kemih ke kandung kemih, serta ke ginjal (menyebabkan pielonefritis), atau prostat pada pria. Karena wanita memiliki uretra yang lebih pendek daripada pria, mereka 14 kali lebih mungkin menderita ISK asendens. Escherichia coli uropatogenik menggunakan P fimbriae (piel terkait pielonefritis) untuk mengikat sel-sel urothelial saluran kemih dan menjajah kandung kemih. Adhesin ini secara khusus mengikat fragmen D-galaktosa-D-galaktosa pada antigen P golongan darah eritrosit dan sel uroepitel. Sekitar 1% dari populasi dunia kekurangan reseptor ini, dan kehadiran atau ketidakhadirannya memediasi kerentanan manusia atau non-kerentanan terhadap infeksi saluran kemih E. coli, masing-masing. Escherichia coli uropatogenik menghasilkan alfa dan beta hemolisin, yang menyebabkan lisis sel saluran kemih. Faktor virulensi lain yang biasanya ada di UPEC adalah keluarga adhesins Dr, yang terutama terkait dengan sistitis dan pielonefritis terkait kehamilan. Dr adhesins mengikat antigen golongan darah Dr (DRA), yang terdapat pada faktor pembusukan yang mempercepat (DAF) pada eritrosit dan jenis sel lainnya. Di sana, Dr adhesins menginduksi pengembangan ekstensi sel panjang yang membungkus bakteri, disertai dengan aktivasi beberapa kaskade pensinyalan, termasuk aktivasi PI-3-kinase. UPEC dapat melewati pertahanan imun bawaan tubuh (misalnya, sistem komplemen) dengan menyerang sel permukaan untuk membentuk komunitas bakteri intraseluler (ICBs). Selain itu, mereka memiliki kemampuan untuk membentuk antigen K, polisakarida kapsuler yang mendorong pembentukan biofilm. E. coli penghasil biofilm tidak dapat dijangkau oleh faktor imun dan terapi antibiotik, dan sering mengganggu perkembangan infeksi kronis saluran kemih. Infeksi E.coli yang menghasilkan antigen K biasanya terjadi pada saluran kemih bagian atas. Infeksi menurun terjadi, meskipun relatif jarang, ketika sel E. coli memasuki organ saluran kemih bagian atas (ginjal, kandung kemih, atau ureter) dari aliran darah.
Meningitis neonatus (NMEC)
Diproduksi oleh serotipe Escherichia coli yang mengandung antigen kapsuler yang disebut K1. Kolonisasi usus neonatus dengan strain ini, yang ada di vagina ibu, menyebabkan bakteremia, yang pada gilirannya menyebabkan meningitis. Dan karena tidak adanya antibodi IgM dari ibu (mereka tidak melewati plasenta karena FcRn hanya memediasi transmisi IgG), selain itu, perlu juga mempertimbangkan fakta bahwa tubuh mengenali antigen K1 sebagai bagian dari dirinya sendiri, karena itu menyerupai glikopeptida serebral, dan mengarah pada perkembangan meningitis tingkat serius pada bayi baru lahir.
Peran dalam perkembangan kanker atau penuaan sel
Ada beberapa strain E.coli yang mengandung genomic polyketide synthase (PKS) island yang berfungsi untuk mengkodekan mekanisme multi-enzimatik yang menghasilkan zat genotoksik yang disebut kolibaktin. Colibactin dapat menyebabkan penuaan sel atau kanker dengan merusak DNA. Namun, penghalang mukosa mencegah E. coli mencapai permukaan enterosit. Hanya ketika beberapa lesi inflamasi berkembang dengan infeksi E. coli, bakteri dapat menyuntikkan kolibaktin ke dalam enterosit, menyebabkan perkembangan tumor.
penyakit hewan
Pada hewan, strain virulen E. coli menyebabkan berbagai penyakit, antara lain - septikemia dan diare pada anak sapi yang baru lahir, mastitis akut pada sapi perah, colibacillosis juga dikaitkan dengan penyakit pernapasan kronis dengan mikoplasma, menyebabkan perihepatitis, perikarditis, paru-paru septik, peritonitis, dll. pada unggas, dan Alabama membusuk pada anjing. Sebagian besar serotipe yang diisolasi dari unggas hanya bersifat patogen untuk unggas. Dengan demikian, sumber unggas E. coli tampaknya tidak menjadi sumber infeksi yang penting pada hewan lain.
Diagnostik laboratorium
Pada sampel tinja, mikroskop akan menunjukkan batang gram negatif, tanpa susunan sel yang spesifik. Kemudian, agar MacConkey atau agar EMB (atau keduanya) diletakkan di dalam tinja. Pada agar MacConkey, koloni merah tua terbentuk karena organisme tersebut positif laktosa dan fermentasi gula ini akan menyebabkan pH rata-rata turun sehingga menghasilkan media yang lebih gelap. Pertumbuhan pada agar EMB menghasilkan koloni hitam dengan kilap metalik hitam kehijauan. Ini berfungsi untuk mendiagnosis E. coli. Organisme ini juga positif lisin, dan tumbuh pada TSI dengan profil (A/A/g+/H2S-). Selain itu, IMViC (+ + - -) untuk E. coli; karena indole positif (cincin merah) dan metil merah positif (merah terang), tetapi VP negatif (tidak ada perubahan - tidak berwarna) dan sitrat negatif (tidak ada perubahan - hijau). Tes untuk toksin dapat menggunakan sel mamalia dalam kultur jaringan, yang dengan cepat dibunuh oleh toksin Shiga. Meskipun metode ini sensitif dan sangat spesifik, namun lambat dan mahal. Biasanya, diagnosis dibuat dengan kultur dalam media sorbitol MacConkey dan kemudian dengan mengetik antiserum. Namun, analisis lateks dan beberapa jenis antiserum sekarang menunjukkan reaksi silang dengan koloni non-E.coli O157. Selain itu, tidak semua galur E. coli O157 yang terkait dengan HUS adalah fermentor non-sorbitol. Dewan Epidemiologi Negara dan Teritorial merekomendasikan agar laboratorium klinis menyaring setidaknya semua tinja berdarah untuk keberadaan patogen ini. Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit AS merekomendasikan, "Semua tinja yang diajukan untuk pengujian rutin pada pasien dengan diare akut yang didapat dari masyarakat (terlepas dari usia pasien, musim, atau ada atau tidak adanya darah dalam tinja) secara bersamaan dikultur untuk E. coli O157 :H7 ( O157 STEC) dan uji dengan uji yang mendeteksi racun Shiga untuk mendeteksi non-O157 STEC."
Terapi dan resistensi antibakteri
Infeksi bakteri biasanya diobati dengan antibiotik. Namun, kerentanan antibiotik bervariasi di antara strain E. coli. Sebagai organisme Gram-negatif, E. coli resisten terhadap banyak antibiotik yang efektif melawan organisme Gram-positif. Antibiotik yang dapat digunakan untuk mengobati infeksi E. coli termasuk amoksisilin serta penisilin semi-sintetik lainnya, banyak sefalosporin, karbapenem, aztreonam, trimetoprim-sulfametoksazol, ciprofloxacin, nitrofurantoin, dan aminoglikosida. Resistensi antibiotik adalah masalah yang berkembang. Sebagian, hal ini disebabkan oleh penggunaan antibiotik yang berlebihan, tetapi sebagian mungkin karena penggunaan antibiotik sebagai pemacu pertumbuhan dalam pakan ternak. Sebuah studi yang diterbitkan dalam jurnal Science pada Agustus 2007 menemukan bahwa tingkat mutasi adaptif pada E. coli adalah "pada urutan 10-5 per genom, per generasi, 1.000 kali lebih tinggi dari perkiraan sebelumnya." Penemuan ini mungkin memiliki implikasi untuk studi dan pengelolaan resistensi antibiotik bakteri. E. coli yang resisten antibiotik juga dapat meneruskan gen resisten antibiotik ke jenis bakteri lain, seperti: Stafilokokus aureus melalui proses yang disebut transfer gen horizontal. Bakteri E.coli sering membawa beberapa plasmid dengan resistensi obat, dan di bawah tekanan dapat dengan mudah mentransfer plasmid ini ke spesies lain. Faktanya, E. coli sering menjadi anggota biofilm, di mana banyak jenis bakteri hidup berdekatan satu sama lain. Pencampuran spesies ini memungkinkan strain E. coli untuk menerima dan mentransfer plasmid ke dan dari bakteri lain. Jadi, E. coli dan enterobakteri lainnya merupakan reservoir penting dari resistensi antibiotik yang dapat diterjemahkan.
Strain beta-laktamase
Resistensi terhadap antibiotik beta-laktam telah menjadi masalah khusus dalam beberapa dekade terakhir karena strain bakteri yang menghasilkan beta-laktamase spektrum luas menjadi lebih umum. Enzim beta-laktamase ini membuat banyak, jika tidak semua, penisilin dan sefalosporin tidak efektif sebagai terapi. E. coli penghasil beta-laktamase spektrum luas (ESBL E. coli) sangat resisten terhadap sejumlah antibiotik, dan infeksi yang disebabkan oleh jenis ini sulit diobati. Dalam banyak kasus, hanya dua antibiotik oral dan kelompok antibiotik intravena yang sangat terbatas yang tetap efektif. Pada tahun 2009, di India dan Pakistan, sebuah gen yang disebut gen metallo-beta-laktamase New Delhi (disingkat NDM-1) ditemukan pada bakteri E. coli, yang memberikan resistensi bahkan terhadap antibiotik carbapenem intravena. Kekhawatiran yang meningkat tentang prevalensi bentuk "superbug" ini di Inggris telah menyebabkan panggilan untuk pemantauan lebih lanjut dan strategi untuk memerangi infeksi dan kematian di seluruh Inggris. Pengujian kerentanan harus menentukan pengobatan semua infeksi yang organismenya dapat diisolasi untuk biakan.
Terapi fag
Terapi fag, penggunaan virus yang menargetkan bakteri patogen, telah dikembangkan selama 80 tahun terakhir, terutama di negara-negara bekas Uni Soviet dimana digunakan untuk mencegah diare yang disebabkan oleh E.coli. Saat ini, terapi fag untuk manusia hanya tersedia di pusat terapi fag di Republik Georgia dan Polandia. Namun, pada tanggal 2 Januari 2007, FDA Amerika Serikat memberikan persetujuan Omnilytics untuk menggunakan fag O157:H7 yang membunuh E. coli pada hewan hidup yang akan disembelih untuk konsumsi manusia. Fag Enterobacteriaceae T4, fag yang dipelajari secara luas, menargetkan E. coli.
Vaksinasi
Para peneliti secara aktif bekerja untuk mengembangkan vaksin yang aman dan efektif untuk mengurangi infeksi E. coli di seluruh dunia. Pada bulan Maret 2006, vaksin yang memunculkan respon imun terhadap E. coli O157:H7 polisakarida spesifik O yang terkonjugasi dengan rekombinan Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (O157-rEPA) dilaporkan aman pada anak-anak usia dua sampai lima tahun. Pekerjaan sebelumnya telah menunjukkan bahwa itu aman untuk orang dewasa. Uji klinis fase III direncanakan untuk menguji kemanjuran pengobatan dalam skala besar. Pada tahun 2006, Fort Dodge Animal Health (Wyeth) memperkenalkan vaksin yang efektif, hidup, dan dilemahkan untuk mengendalikan aerocystitis dan peritonitis pada ayam. Vaksin ini adalah vaksin avirulen yang dimodifikasi secara genetik yang telah menunjukkan perlindungan terhadap O78 dan strain non-typable. Pada bulan Januari 2007, perusahaan biofarmasi Kanada Bioniche mengumumkan pengembangan vaksin ternak yang mengurangi jumlah O157:H7 dalam pupuk kandang dengan faktor 1000, yaitu, akan membunuh sekitar 1000 bakteri patogen per gram pupuk kandang. Pada April 2009, seorang peneliti Michigan State University mengumumkan bahwa dia telah mengembangkan vaksin yang berfungsi untuk strain E. coli. Dr. Mahdi Saeed, Profesor Epidemiologi dan penyakit menular di Michigan State University Colleges of Veterinary Medicine and Human Medicine, mengajukan paten untuk penemuannya dan melakukan kontak dengan perusahaan farmasi untuk produksi komersialnya.
"Kursus Phage - Asal". Laboratorium Pelabuhan Mata Air Dingin. 2006. Diarsipkan dari versi asli tanggal 16 September 2006. Diakses tanggal 12-12-03BAHAN: invensi ini berkaitan dengan bioteknologi dan masalah memperoleh produsen untuk preparat probiotik - preparat bakteri berdasarkan kultur hidup mikroorganisme simbion yang digunakan untuk pencegahan dan pengobatan disbakteriosis dan gangguan lain pada saluran pencernaan. Sebuah plasmid p olap non-konjugatif, non-mobilizable dimasukkan ke dalam strain Escherichia coli M17, produsen untuk persiapan probiotik colibacterin, membawa gen untuk produksi colicin E1 dan penentu resistensi terhadap ampisilin pada dosis hingga 150 mg /l. Strain yang dihasilkan tidak memiliki fenotipe perekat yang tidak diinginkan dengan menonaktifkan gen adhesin fimH pili tipe 1 dengan mengintegrasikan gen resistensi kanamisin - neomisin npt. Strain E.coli M17 fim H::Kan/p Colap diendapkan dengan VKPM dengan nomor B-7448. Hal ini memungkinkan Anda untuk membuat preparat probiotik dengan kemampuan yang berkurang untuk menjajah ceruk selain usus, dengan peningkatan aktivitas antagonis dan residen dengan latar belakang terapi antibiotik. Fitur-fitur yang dimasukkan ke dalam galur yang dibangun secara stabil diawetkan dalam populasi. Ini memfasilitasi persiapan sediaan standar berdasarkan strain dan memastikan bahwa ketika sediaan diambil oleh pasien tanpa terapi antibiotik bersamaan, eliminasi plasmid tidak terjadi. 4 sakit., 1 tab.
Invensi ini berhubungan dengan bioteknologi dan berkaitan dengan pembuatan galur Escherichia coli yang lebih baik, yang dapat digunakan untuk mendapatkan probiotik - sediaan bakteri berdasarkan biakan hidup mikroorganisme simbion. Probiotik (nama lain obat dalam kelompok ini: normoflora, eubiotik, mikrobiotik) adalah alat yang efektif untuk pencegahan dan pengobatan dysbacteriosis usus. Dysbacteriosis adalah perubahan nyata dalam spesies dan rasio kuantitatif mikroba, yang memanifestasikan dirinya dalam perkembangan pesat mikroorganisme oportunistik, khususnya bakteri dari kelompok usus (Enterobacteriaceae), dan disertai dengan berbagai manifestasi yang menyakitkan. Penyebab penting dari dysbacteriosis adalah penggunaan antibiotik dan lainnya antimikroba[Krasnogolovets VN "signifikansi klinis dysbacteriosis usus akibat penggunaan antibiotik". Dalam buku. "Penggunaan colibacterin untuk pencegahan dan pengobatan penyakit usus dan teknologi produksinya". M., 1967, hlm. 223 - 243]. Saat ini, preparat probiotik "Colibacterin" dan "Bifikol" dikenal di Rusia, yang diperoleh berdasarkan strain Escherichia coli M17, yang, pada dasarnya, merupakan turunan dari strain E. coli yang diisolasi oleh A. Nissle dan digunakan untuk memperoleh obat "Mutaflor" (Jerman) [Peretz LG "Dry colibacterin. Metode baru diagnosa, pengobatan dan pencegahan penyakit usus".Dalam buku "Abstrak laporan ke Pleno Uch. sayang. burung hantu Kementerian Kesehatan RSFSR ". M., 1961, hlm. 52-54]. Namun, tidak seperti galur aslinya, galur E. coli M17 kehilangan kemampuan untuk mensintesis colicin B dan, oleh karena itu, mengurangi aktivitas antagonisnya terhadap bakteri dari kelompok usus [Shemchuk L .F. "Standardization of colibacterin", Abstract of Candidate of Biological Sciences, M., 1983, p. 16]. , tidak biasa dan tidak diinginkan untuk strain usus. Fenotipe seperti itu sering ditemukan pada strain diisolasi dari makroorganisme dengan infeksi saluran kemih dan pneumonia nosokomial [Sokurenko EV, Chesnokova VL "Sebuah metode untuk memodifikasi fenotipe perekat isolat E. coli liar seperti yang diterapkan pada strain - produsen obat colibacterin". Buletin Biologi Eksperimental dan Kedokteran, 1997, Volume 124, N 9, hlm. 334 - 338]. Kelemahan dari galur E. coli M17 juga adalah kepekaannya terhadap antibiotik, oleh karena itu preparat berbahan dasar itu tidak dapat efektif aktif dengan latar belakang antibiotik. Sementara itu, penggunaan antibiotik dan probiotik secara simultan dapat mencegah perkembangan dysbacteriosis dan dengan demikian meningkatkan efektivitas tindakan terapeutik, mengurangi durasi pengobatan. Tujuan dari penemuan ini adalah untuk membuat galur E. coli - turunan dari E. coli M17, yang memungkinkan untuk menghilangkan kerugian di atas dari galur E. coli M17 yang diketahui, yaitu: aktivitas antagonis yang berkurang, fenotipe perekat yang tidak diinginkan, kepekaan terhadap antibiotik. Hasil teknis terdiri dalam membangun strain dengan aktivitas antagonis meningkat, mengurangi kemampuan untuk menjajah ceruk selain ceruk usus utama dalam makroorganisme dan dengan resistensi terhadap dosis moderat antibiotik penisilin. Tujuan ini dicapai dengan menggunakan metode rekayasa genetika dan genetika untuk membangun galur E. coli M17 fimH::kan/pColap, yang menghasilkan colisin E1, tahan terhadap konsentrasi ampisilin sedang (hingga 150 IU/ml) dan mengandung gen fimH yang tidak aktif, mengkode adhesin fimbrial. Strain E. coli M17 fimH::kan/pColap diendapkan dengan Koleksi Mikroorganisme Industri Seluruh Rusia dengan nomor registrasi B-7448. Desain regangan yang dipatenkan didasarkan pada ketentuan berikut. Kami telah menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa inaktivasi gen adhesin fimH tipe 1 pili dalam genom Escherichia coli strain M17 dan pengenalan plasmid pColap non-konjugatif yang tidak dapat digerakkan yang membawa gen untuk produksi colicin E1 dan penentu resistensi terhadap ampisilin pada dosis hingga 150 mg/l ke dalam strain Escherichia coli M17 memungkinkan Anda untuk membuat persiapan probiotik dengan kemampuan yang berkurang untuk menjajah ceruk selain usus, dengan peningkatan aktivitas antagonis dan penduduk dengan latar belakang antibiotik terapi. Inti dari solusi rekayasa genetika yang dipatenkan diilustrasikan oleh gambar, di mana:
Dalam Gambar. 1 menunjukkan skema untuk memperoleh galur rekombinan E. coli M17fimH::kan/pColap dengan defek pada gen adhesin fimH pili tipe 1,
Dalam Gambar. 2 - skema konstruksi pColap plasmid hibrida,
Dalam Gambar. Gambar 3 menunjukkan hasil studi aktivitas adhesif Escherichia coli strain M17 fimH::kan/pColap,
Dalam Gambar. 4 - hasil studi stabilitas strain Escherichia coli M17 fimH::kan/pColap. Setelah menerima galur E. coli M17 fimH::kan/pColap sebagai sumber, digunakan analog terdekatnya - galur E. coli M17. Untuk menghilangkan adhesin fimbrial, yang memberikan fenotipe Mn yang sangat berperekat yang tidak diinginkan ke sel E. coli M17, strain rekombinan diperoleh di mana gen resistensi kanamisin-neomisin npt diintegrasikan ke dalam gen fimH kromosom yang mengkode adhesin. Untuk tujuan ini, plasmid pCH103 digunakan, turunan dari plasmid R6K, yang memiliki sistem replikasi yang bergantung pada pir dan hanya dapat dipertahankan pada galur yang mengandung gen pir yang memastikan replikasinya [Sokurenko E.V., Chesnokova V.L. "Sebuah metode untuk memodifikasi fenotipe perekat dari isolat E. coli liar dalam aplikasi untuk strain - produsen obat colibacterin". Buletin Biologi Eksperimental dan Kedokteran, 1997, Volume 124, N 9, hlm. 334 - 338]. Plasmid pCH103 membawa gen resistensi ampisilin dan fragmen kromosom yang mengandung gen klaster fim, di mana integritas gen fimH terganggu oleh penyisipan gen resistensi kanamisin (neomisin) npt. Setelah transformasi menjadi E. coli M17, ia tidak dapat dipertahankan dalam sel, dan transforman resisten kanamisin dapat muncul baik dengan mengintegrasikannya seluruhnya ke dalam kromosom sebagai hasil dari persilangan tunggal atau sebagai akibat dari persilangan ganda (Gbr. .1). Transforman kelas kedua tetap sensitif terhadap ampisilin. Di antara mereka, strain yang ditunjuk E. coli M17fimH::kan (atau M17 fimH::npt) dipilih. Studi yang dilakukan mengkonfirmasi tidak adanya adhesi mannose-sensitif pada strain yang diperoleh; FimH - fenotipe. Untuk meningkatkan aktivitas antagonis dari strain E. coli M17 dan membuatnya resisten terhadap ampisilin berdasarkan plasmid ColE1 dengan metode yang dikenal ["Methods of molecular genetics and genetic engineering", 1990, Novosibirsk, "Nauka", cabang Siberia, hlm. 7-10, 39-44] sebuah pColap plasmid hibrida dibangun (Gbr. 1). Plasmid ColE1 asli, diisolasi dari strain E. coli non-patogen, telah dipelajari secara rinci. Ini memiliki kisaran inang yang agak sempit (terutama strain Escherichia coli) dan dipertahankan secara stabil dalam sel bakteri. Urutan nukleotida lengkapnya, fungsi semua elemen genetiknya, dan pengaturan aktivitasnya diketahui. Plasmid menentukan sintesis colicin E1, yang memiliki efek merugikan pada sel-sel bakteri terkait. Kerugian dari plasmid ColE1 adalah kemampuannya untuk memobilisasi ke dalam sel lain menggunakan plasmid konjugatif, yang disebabkan oleh adanya wilayah massa dalam strukturnya. Dengan menggunakan endonuklease restriksi BspLu11.1, wilayah ini dihilangkan sepenuhnya dan, pada saat yang sama, elemen genetik lain dari plasmid praktis tidak terpengaruh. Kemudian, dengan menggunakan endonuklease restriksi BspH1, sebuah fragmen yang mengandung gen b1a yang mengkode sintesis laktamase dikeluarkan dari vektor pUC19 yang diketahui dan diikat dengan fragmen plasmid ColE1 yang tidak memiliki daerah mob. Hasilnya adalah plasmid pColap. Plasmid ini bersifat non-konjugatif dan tidak dapat dimobilisasi dan, oleh karena itu, secara praktis tidak dapat dipindahkan ke sel bakteri lain. Berbeda dengan vektor pUC19 dan plasmid lainnya, pColap hanya memberikan tingkat resistensi ampisilin yang moderat terhadap strain E. coli yang telah diubahnya (Tabel 1). Penurunan ekspresi gen - laktamase seperti itu diamati karena pelanggaran di wilayah promotor gen (kotak Gilbert) dan wilayah 5", yang meningkatkan efisiensi ekspresi, yang terjadi sebagai akibat dari manipulasi genetik selama konstruksi plasmid pColap rekombinan. Sensitivitas galur yang membawa pColap terhadap peningkatan konsentrasi antibiotik harus dipertimbangkan sebagai faktor yang menguntungkan. Jadi, jika karena alasan tertentu keberadaan galur yang mengandung plasmid ini di usus pasien menjadi tidak diinginkan, atau jika sebagai hasil dari beberapa peristiwa luar biasa, plasmid dipindahkan ke strain lain, maka semua sel yang mengandungnya dapat dihilangkan dari tubuh menggunakan konsentrasi tinggi -antibiotik laktam Plasmid pColap digunakan untuk mengubah strain E. coli M17 fimH::kan menjadi E. coli strain M17 fimH::kan/pColap. Strain memiliki ciri-ciri sebagai berikut. Morfologi. Gram-negatif, batang tipis yang bergerak lemah dengan ujung membulat sepanjang 1,5 - 2 mikron. Tanda-tanda budaya dan fisiologis. Agar-agar pepton daging dan kaldu agar-agar Hotinger. Setelah 36 jam pertumbuhan pada suhu 37 o C membentuk koloni bulat berwarna putih bening dengan diameter 1,5 - 2,5 mm, permukaan koloni halus, tepi rata, struktur homogen, konsistensi pucat, mudah teremulsi. Agarized minimal medium M9 dengan glukosa (0,2%). Setelah 40 jam pertumbuhan, membentuk koloni dengan diameter 1-2 mm, keputihan keabu-abuan, tembus cahaya, bulat, cembung, dengan tepi halus. Kaldu daging-pepton dan kaldu Hotinger. Setelah 18-24 jam pertumbuhan pada 37 o C ada kekeruhan seragam yang kuat, endapan kecil, bau khas. Cair minimal medium M9 dengan glukosa (0,2%). Setelah 20-24 jam pertumbuhan dengan aerasi, kekeruhan seragam yang kuat diamati, baunya lemah atau tidak ada. Pertumbuhan dengan injeksi dalam agar daging-pepton. Pertumbuhan yang baik selama injeksi. Mikroorganisme adalah anaerob fakultatif. Kaitannya dengan suhu dan pH lingkungan. Tumbuh baik pada suhu 30 hingga 42 o C dan pada pH 6,8 - 7,2. sifat biokimia. Baik menyerap glukosa, sukrosa, laktosa, fruktosa, mannose, xylose, manitol dan sorbitol dengan pembentukan asam dan gas. Rhamnose, galaktosa dan arabinosa - dengan pembentukan asam lemah; salisin - dengan pembentukan asam dan gas yang tertunda; raffinose - hanya dengan pembentukan asam. Inositol tidak diserap. Hidrogen sulfida tidak terbentuk; menghasilkan indol. sikap terhadap antibiotik. Tahan terhadap ampisilin pada konsentrasi dalam medium hingga 150 mg/L. produksi bakteriosin. Menghasilkan kolikin E1. konten plasmid. Sel-sel tersebut mengandung pColap plasmid multikopi non-konjugatif dan tidak dapat dimobilisasi (5239 bp), yang menentukan resistensi ampisilin dan sintesis colisin E1. Strain memiliki formula antigenik O2:L1:H6 dan diaglutinasi oleh serum pada titer serum minimal 1:64000. Invensi ini diilustrasikan dengan contoh-contoh yang mencirikan resistensi galur-galur yang membawa berbagai plasmid terhadap ampisilin, stabilitas sifat-sifatnya selama penanaman. Contoh 1. Studi pertumbuhan E. coli strain M17 dan turunannya yang mengandung plasmid pada media dengan konsentrasi ampisilin yang berbeda (Tabel 1). Strain yang dipelajari dari Escherichia coli (tabel 1) ditumbuhkan selama 18 jam dalam kaldu Luria (LB - 10 g tripton, 5 g ekstrak ragi, 5 g NaCl per 1 liter air suling) pada suhu 37 o C dengan aerasi. Kemudian pengenceran serial kultur bakteri disiapkan hingga 10 -7 dalam salin fisiologis dan setiap kultur ditaburkan di piring dengan LA (LB + 1,6% agar) yang mengandung ampisilin pada konsentrasi berikut (µg/ml): 5, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250. Pertumbuhan koloni dinilai setelah 18-24 jam Hasilnya disajikan pada tabel 1. Seperti dapat dilihat dari tabel 1, galur asli Escherichia coli M17 sangat sensitif terhadap ampisilin. Plasmid pUC19 yang terkandung dalam galur M17/pUC19, yang merupakan sumber gen laktamase untuk plasmid pColap yang kami buat, memberikan sel bakteri resistensi terhadap konsentrasi ampisilin hingga 2 g/l. Pada saat yang sama, plasmid pColap yang terkandung dalam strain M17 fimH::kan/pColap memberikan resistensi terhadap konsentrasi ampisilin yang tidak melebihi 150 mg/L. Dengan demikian, galur yang dihasilkan memiliki tingkat resistensi sedang terhadap ampisilin. Contoh 2. Studi sifat perekat dan penentuan fenotipe perekat strain E. coli M17 dan turunannya. Fenotipe perekat ditentukan dengan metode standar "studi pertumbuhan". Suspensi sel bakteri dalam salin fisiologis dibuat dari kultur segar strain bakteri yang dipelajari dengan kerapatan optik 1,0 pada panjang gelombang 540 nm. Secara paralel, pelat mikrotiter disiapkan dengan sumur dasar datar dengan substrat yang diimobilisasi dalam sumur untuk adhesi, yaitu: MN (ragi mannan), PH (bovine RNase B) dan BSA (albumin serum sapi). Kemudian suspensi bakteri dimasukkan ke dalam sumuran dan diinkubasi selama 40 menit. Sel bakteri yang tidak terikat dicuci bersih garam . Sumur ditambahkan media kaya nutrisi dan diinkubasi dengan pengadukan konstan pada suhu 37 o C selama 2,5 - 3 jam sampai munculnya kekeruhan di dalam sumur. Kerapatan optik di setiap sumur dibaca pada pembaca pelat mikro otomatis (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, California, USA). Dalam percobaan ini, strain E. coli berikut dipelajari: M17 - strain asli; M17 fimH::kan - Strain M17 dengan gen adhesin fimH yang tidak aktif: M17 fimH: : kan/pPKL91 - strain fimH::kan ditransformasikan dengan plasmid pPKL91 yang mengandung gen pengatur fimB, termasuk ekspresi pili tipe 1 oleh sel bakteri ; strain M17fimH::kan/pColap - M17 fimH::kan strain yang ditransformasikan dengan plasmid pColap yang kami buat, membawa determinan resistensi terhadap ampisilin dan produksi colicin E1. Hasil studi aktivitas perekat dari strain E. coli M17 dan turunan dari strain E. coli M17, dievaluasi dengan menggunakan metode "studi pertumbuhan", disajikan pada Gambar. 3 (ordinat menunjukkan nilai kerapatan optik pada panjang gelombang 540 nm; absis menunjukkan strain E. coli yang dipelajari: 1 - M17; 2 - M17 fimH::kan, 3 - M17fimH::kan/pPKL91, 4 - M17 fimH ::kan/pColap). Seperti dapat dilihat dari Gambar. 3, galur E. coli asli M17 mengikat baik RNase B dan mannan, menunjukkan fenotipe perekat MH yang tidak diinginkan untuk galur usus E. coli. Strain rekombinan M17 fimH::kan yang kami peroleh menunjukkan aktivitas perekat nol baik dengan sendirinya maupun setelah pengenalan plasmid ke dalamnya, termasuk ekspresi pili tipe 1. Aktivitas perekat nol dipertahankan dalam strain ini bahkan setelah pengenalan plasmid pColap (strain M17 fimH::kan/pColap). Contoh 3. Studi stabilitas sifat Escherichia coli strain M17 fimH::kan/pColap ditentukan oleh plasmid pColap. Plasmid pColap yang kami buat memastikan produksi colicin E1 dan resistensi terhadap ampisilin. Pelestarian fitur-fitur ini tergantung pada stabilitas pemeliharaan plasmid dalam sel bakteri: hilangnya plasmid disertai dengan hilangnya fitur yang sesuai. Stabilitas mempertahankan resistensi terhadap ampisilin dan colicinogenicity dari strain yang diperoleh ditentukan ketika mereka dibudidayakan dalam media nutrisi cair tanpa adanya agen selektif selama 100 generasi. Plasmid ColE1 asli digunakan sebagai kontrol positif, dan plasmid pBR322, turunan ColE1 yang tidak mengandung cer locus, yang mempengaruhi stabilitas plasmid, digunakan sebagai kontrol negatif. Kultur galur M17 fimH::kan/pColap, M17/ColE1 dan M17/pBR322 ditumbuhkan selama 18 jam dengan aerasi yang ditingkatkan pada 37 o C dalam LB dengan ampisilin (100 g/ml). Strain M17/ColE1 ditumbuhkan pada kondisi yang sama tetapi tanpa ampisilin. Kultur yang dihasilkan mengandung sekitar 10 sel bakteri per ml. Kemudian, 10 l (10 6) kultur bakteri yang sesuai ditambahkan ke tabung dengan 10 ml LB (tanpa antibiotik tambahan). Suspensi yang dihasilkan ditumbuhkan seperti dijelaskan di atas. Dengan kultivasi tersebut, sel bakteri sempat melewati 10 kali pembelahan. Dengan mengulangi operasi ini 10 kali, kami memperoleh kultur bakteri yang telah melewati 100 generasi sejak inokulasi pertama ke dalam media tanpa agen selektif. Sampel kultur bakteri diambil sebelum setiap inokulasi dan diuji untuk sifat resistensi ampisilin dan produksi colisin. Untuk ini, suspensi sel dilapisi pada pelat LA sampai koloni individu diperoleh. Kemudian, 100 koloni dari masing-masing strain diuji kemampuannya untuk tumbuh pada media yang sama dengan adanya ampisilin (100 g/ml). Selain itu, koloni-koloni tersebut diuji kemampuannya menghasilkan colicin E1. Untuk ini, tes digunakan dengan aplikasi agar bagian atas (Miller J. "Eksperimen dalam genetika molekuler", M., "Mir", 1976, hlm. 183-189). Pengujiannya adalah sebagai berikut: pada pelat dengan media nutrisi padat yang mengandung agar 1,6%, koloni yang diteliti ditusuk dengan replikator atau tusuk gigi. Pelat diinkubasi pada 37°C selama 3-4 jam, produksi kolisin diinduksi oleh penyinaran ultraviolet selama 4-5 detik dan diinkubasi dalam kondisi yang sama semalaman. Sel-sel kemudian dilisiskan dengan uap kloroform pada suhu kamar selama 30-40 menit. Penting untuk memastikan bahwa pada langkah berikutnya semua kloroform telah menguap dari cangkir. Letakkan di lapisan bawah agar 3 - 5 ml agar semi-cair (0,7%) yang mengandung 10 7 / ml sel bakteri strain uji E. coli (sensitif terhadap colicin E1). Diinkubasi semalaman pada suhu 37 o C. Catat keberadaan zona pencerahan di lapisan kultur uji di sekitar tempat galur yang diteliti. Hasil stabilitas dari strain Escherichia coli M17/pColap yang dibangun ditunjukkan pada Gambar. 2 (ColE1 sesuai dengan strain M17/ColE1, pBR322 dengan strain M17/pBR322, pColap dengan strain M17/pColap). Kehadiran plasmid dalam sel bakteri mengikuti dari pelestarian sifat aslinya (kolisinogenisitas dan/atau resistensi terhadap ampisilin). Hasil percobaan (Gbr. 2) menunjukkan bahwa plasmid pBR322 yang dideprivasi cer lokus dengan cepat dieliminasi dari populasi bakteri ketika ditumbuhkan dalam media yang deprivasi antibiotik, sedangkan dua plasmid lainnya (ColE1 asli dan pColap rekombinan) diturunkan secara stabil oleh sel dalam kondisi ini. Sifat ini adalah salah satu keuntungan penting dari desain kami, karena, di satu sisi, memfasilitasi persiapan preparasi standar berdasarkan strain yang mengandung pColap, dan, di sisi lain, memastikan bahwa eliminasi plasmid tidak terjadi. ketika obat diminum oleh pasien tanpa terapi antibiotik bersamaan. Penerapan industri. Uraian di atas tentang metode pembuatan galur Escherichia coli M17 rimH::kan/pColap yang dipatenkan sudah cukup untuk mereproduksi galur tersebut menggunakan teknik standar, reagen dan peralatan yang digunakan dalam penelitian rekayasa genetika.