Reaksi kualitatif terhadap asam amino, peptida, protein. Penentuan asam amino Analisis kualitatif dan kuantitatif asam amino

Asam amino dapat dideteksi dengan menggunakan reaksi warna: ninhidrin, xantoprotein, Fol, Milon, tes biuret, dll. Reaksi ini tidak spesifik, karena didasarkan pada deteksi fragmen individu dalam struktur asam amino, yang juga dapat terjadi pada senyawa lain.

Reaksi ninhidrin, reaksi warna yang digunakan untuk kualitatif dan hitungan asam amino, asam imino, dan amina. Ketika dipanaskan dalam media basa ninhidrin (triketohidrindenhidrat, C 9 H b O 4) dengan zat yang memiliki gugus amino primer (-NH 2), produk akan terbentuk yang memiliki warna biru-ungu yang stabil dengan penyerapan maksimum sekitar 570 nm. Karena penyerapan pada panjang gelombang ini bergantung secara linier pada jumlah gugus amino bebas, reaksi ninhidrin menjadi dasar penentuan kuantitatifnya dengan kolorimetri atau spektrofotometri. Reaksi ini juga digunakan untuk menentukan gugus amino sekunder (> NH) dalam asam imino - prolin dan hidroksiprolin; dalam hal ini, produk kuning cerah terbentuk. Sensitivitas - hingga 0,01%. Analisis asam amino otomatis modern dilakukan dengan menggabungkan pemisahan pertukaran ion asam amino dan penentuan kuantitatifnya menggunakan reaksi ninhidrin. Saat memisahkan campuran asam amino dengan kromatografi kertas, setiap asam amino dapat ditentukan dalam jumlah paling sedikit 2-5 g.

Jumlah asam amino dapat dinilai dari intensitas warnanya.

Reaksi ini tidak hanya positif asam amino bebas tetapi juga peptida, protein, dll.

reaksi xantoprotein memungkinkan Anda untuk mendeteksi asam amino aromatik (fenilalanin, tirosin, histidin, triptofan), berdasarkan reaksi substitusi elektrofilik dalam inti aromatik (nitrasi).

Di bawah aksi asam nitrat pekat, misalnya, pada tirosin, produk kuning terbentuk.

reaksi Fohl. Ini adalah reaksi terhadap sistein dan sistin. Selama hidrolisis alkali, "belerang yang terikat lemah" dalam sistein dan sistin agak mudah dipisahkan, menghasilkan pembentukan hidrogen sulfida, yang, bereaksi dengan alkali, menghasilkan natrium atau kalium sulfida. Ketika timbal(II) asetat ditambahkan, endapan timbal(II) sulfida abu-abu-hitam terbentuk.

Deskripsi pengalaman. Tuang 1 ml larutan sistin ke dalam tabung reaksi, tambahkan 0,5 ml larutan natrium hidroksida 20%. Campuran dipanaskan sampai mendidih, kemudian ditambahkan 0,5 ml larutan timbal(II) asetat. Endapan timbal(II) sulfida abu-abu-hitam diamati:

reaksi Zimmerman. Ini adalah reaksi terhadap asam amino glisin.

Deskripsi pengalaman. Untuk 2 ml larutan 0,1% glisin, dibawa dengan penambahan larutan alkali 10% ke pH = 8, tuangkan 0,5 ml larutan air dialdehida o-ftalat. Campuran reaksi mulai perlahan berubah menjadi hijau terang. Setelah beberapa menit, endapan hijau muncul.

respon terhadap triptofan. Triptofan, bereaksi dalam lingkungan asam dengan aldehida, membentuk produk kondensasi berwarna. Misalnya, dengan asam glioksilat (yang merupakan pengotor pada asam asetat pekat), reaksi berlangsung menurut persamaan:

Reaksi triptofan dengan formaldehida berlangsung menurut skema yang sama.

Reaksi Sakaguchi. Reaksi terhadap asam amino arginin ini didasarkan pada interaksi arginin dengan -naftol dengan adanya zat pengoksidasi. Mekanismenya belum sepenuhnya dijelaskan. Rupanya, reaksi dilakukan sesuai dengan persamaan berikut:

Karena turunan dari quinoneimines (dalam kasus ini naftokuinon), di mana hidrogen dari gugus imino –NH– digantikan oleh radikal alkil atau aril, selalu berwarna kuning-merah, kemudian, tampaknya, warna oranye-merah larutan selama reaksi Sakaguchi disebabkan dengan munculnya turunan naftokuinon imina. Namun, kemungkinan pembentukan senyawa yang lebih kompleks karena oksidasi lebih lanjut dari gugus NH yang tersisa dari residu arginin dan cincin benzena dari -naftol tidak dikecualikan:

Deskripsi pengalaman. Tuang 2 ml larutan arginin 0,01% ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 2 ml larutan natrium hidroksida 10% dan beberapa tetes 0,2% larutan alkohol-naftol. Isi tabung diaduk rata, ditambahkan 0,5 ml larutan hipobromit dan diaduk kembali. 1 ml larutan urea 40% ditambahkan segera untuk menstabilkan warna merah jingga yang berkembang pesat.

Reaksi biuret- digunakan sebagai reaksi warna untuk protein. Dalam lingkungan basa dengan adanya garam tembaga(II), mereka memberikan warna ungu. Warna ini disebabkan oleh pembentukan senyawa kompleks tembaga(II), karena gugus peptida -CO-NH- yang merupakan ciri dari protein. Reaksi ini mendapatkan namanya dari turunan urea - biuret, yang dibentuk dengan memanaskan urea dengan eliminasi amonia:

Selain protein dan biuret, senyawa lain yang mengandung gugus ini juga memberikan pewarnaan yang sama: amida, imida asam karboksilat, serta senyawa yang mengandung gugus -CS-NH- atau \u003d CH-NH- dalam molekulnya. Protein, beberapa asam amino, peptida, biuret dan pepton sedang juga memberikan reaksi.

Warna kompleks yang diperoleh dari reaksi biuret dengan peptida yang berbeda agak berbeda dan tergantung pada panjang rantai peptida. Peptida dengan panjang rantai empat residu asam amino ke atas membentuk kompleks merah, tripeptida - ungu, dan dipeptida - biru.

bentuk keton dari polipeptida

enol bentuk polipeptida

Ketika polipeptida berinteraksi dengan Cu (OH) 2, kompleks terbentuk, yang strukturnya dapat ditunjukkan sebagai berikut.

Peralatan dan reagen: kertas kromatografi; ruang kromatografi; kolorimeter fotolistrik; gunting; piring kaca (3x32 cm) - 3 pcs.; pemegang untuk kromatogram; lemari pengering; mikropipet; tabung reaksi dengan ground stopper; buret 25 ml; campuran standar asam amino; campuran uji asam amino; butanol, asam asetat, air dengan perbandingan 15:3:7; larutan ninhidrin 1% dalam aseton 95%; etil alkohol (75%), jenuh dengan tembaga sulfat.

Menyelesaikan pekerjaan

Ambil selembar kertas kromatografi berukuran 18x28 cm dan buat garis horizontal dengan pensil sederhana pada jarak 3 cm dari tepi pendeknya. Kemudian dibagi menjadi segmen yang tidak sama sesuai dengan skema terlampir dan batas penerapan standar dan campuran uji ditandai dengan panah dan tulisan yang sesuai dibuat dengan pensil sederhana.

Kertas difiksasi di atas permukaan meja dan pada garis start, dibatasi oleh tanda panah, campuran standar dioleskan terlebih dahulu dengan mikropipet khusus dalam garis tipis sampai seluruh larutan dari mikropipet dipindahkan ke garis start (mikropipet diisi 2-3cm). Massa larutan yang dioleskan diukur dengan menimbang pipet berisi campuran standar (sebelum menerapkan larutan) dan kosong (setelah menerapkan larutan). 0,02-0,03 g larutan standar biasanya diterapkan pada kertas. Kemudian isi pipet bersih dengan campuran asam amino yang akan diuji (diberikan oleh guru untuk pembelajaran), timbang dan oleskan campuran tersebut ke garis start dengan tanda yang sesuai.

Kromatogram yang telah disiapkan ditempatkan dalam ruang kromatografi dengan sistem pelarut yang sebelumnya dituangkan ke dalamnya untuk memisahkan campuran asam amino, misalnya campuran butanol, asam asetat dan air dengan perbandingan 15:3:7. Pemisahan dilakukan dengan kromatografi menaik sampai garis depan mencapai 2-3 cm sampai tepi atas kertas kromatografi (garis finis). Setelah itu, kromatogram dikeluarkan dari chamber dan ujung atas kertas segera dimasukkan ke dalam holder yang terbuat dari tiga batang kaca yang diikat dengan cincin karet dan ditempatkan di lemari asam selama 20 menit untuk menghilangkan pelarut dari kertas.

Beras. 8. Skema susunan asam amino pada kromatogram:

A - titik penerapan campuran asam amino; I - sistin dan sistein;

2 - lisin; 3 - histidin; 4 - arginin; 5 - asam aspartat,

seri dan glisin; 6 - asam glutamat dan treonin; 7 - alanin;

8 - prolin; 9 - tirosin; 10 - valin dan metionin; II - triptofan;

12 - fenilalanin; 13 - leusin dan isoleusin

Kromatogram kering dicelupkan ke dalam larutan ninhidrin 1% dalam aseton untuk mendeteksi posisi bercak asam amino di atasnya. Kemudian kromatogram ditempatkan selama 10 menit dalam lemari asam untuk menghilangkan aseton dan dipindahkan ke oven, di mana dibiarkan selama 15 menit pada 70°C. Asam amino dari campuran standar dan uji dideteksi sebagai bintik biru-ungu yang tersusun dalam rantai searah sistem pelarut dari garis awal hingga tepi atas kromatogram.

Identifikasi asam amino yang terkandung dalam campuran uji dilakukan secara kebetulan pada kromatogram dari posisi yang ditempati oleh asam amino dari campuran standar dan campuran uji (Gbr. 8).

Untuk menentukan kandungan kuantitatif asam amino dalam campuran uji, kromatogram digambar dengan pensil sederhana sehingga zona berwarna yang terletak pada tingkat yang sama, sesuai dengan asam amino yang sama, tertutup dalam persegi panjang yang hampir identik (Gbr. 9) .

I II III IV

Beras. 9. Skema susunan asam amino pada kromatogram:

I - campuran No. I; II - campuran No. 2; 1U - campuran No. 3; - standar

campuran asam amino

Bagian kertas yang digariskan dipotong dan ditempatkan dalam tabung reaksi, yang jumlahnya harus sesuai dengan jumlah bintik pada kromatogram. 10 ml larutan 75% etil alkohol jenuh dengan madu sulfat dituangkan ke dalam setiap tabung reaksi dari buret (0,2 ml larutan jenuh tembaga sulfat ditambahkan ke 500 ml etil alkohol). Tabung reaksi ditutup dengan gabus dan, secara berkala diaduk, transisi lengkap warna merah bata (garam tembaga biru-ungu Rueman) dicapai dari kertas ke dalam larutan. Ini membutuhkan waktu 15-20 menit. Absorbansi (kerapatan optik) larutan standar dan larutan uji diukur pada fotoelektrokalorimeter dengan filter lampu hijau (540 nm). Sebuah kuvet dengan larutan 75% etil alkohol dengan tembaga sulfat dipasang di aliran referensi.

Kandungan kuantitatif asam amino dalam larutan uji dihitung dari rasio kepunahan sampel uji dan sampel standar.

Contoh perhitungan. Asumsikan bahwa campuran standar mengandung 1,8 mg glisin dalam 1 ml, 0,02 g larutan standar ini diterapkan pada strip awal. Oleh karena itu, kromatogram yang diterima (1,8 × 0,02) = 0,036 mg glisin. Mari kita sepakati lebih lanjut bahwa absorbansi larutan berwarna adalah 0,288 untuk standar dan 0,336 untuk campuran yang tidak diketahui. Kemudian kandungan glisin dalam campuran uji yang diterapkan pada kromatogram adalah (36´0.336): 0,288=42 g. Jika kita selanjutnya mengasumsikan bahwa campuran uji diterapkan pada kromatogram dalam jumlah, misalnya, 0,0250 g, maka kandungan glisin dalam 1 ml larutan uji adalah (42: 0,0250) = 1680 g, atau 1,68 mg / ml.

Buat hasil percobaan Anda sendiri, buat kesimpulan darinya.

Lab #15

pemisahan ionFe 3+ , bersama 2+ , Ni 2+

Dan protein

Diketahui bahwa semua 20 varietas asam -amino kanonik memiliki struktur yang sama, dengan tiga varian gugus fungsi (Gbr. 3.3). Sayangnya, reaksi terhadap gugus amino dan karboksi tidak terlalu spesifik, karena masing-masing, karakteristik dari semua amina, sejumlah amida dan asam karboksilat. Hal yang sama berlaku untuk sebagian besar radikalnya = R, 10 di antaranya adalah non-polar, yaitu, mereka diwakili oleh gugus alifatik = hidrokarbon, yang sebagian besar bersifat inert secara kimia. Spesifisitas sebagian besar asam amino polar R juga relatif rendah, di mana alkohol (Ser, Tre, Tyr) amida (Acn, Gln) dan gugus karboksil (Asp, Glu) terjadi. Gugus amino (Liz), imidazol His, dan gugus guanidino Arg lebih aktif, sedangkan aktivitas gugus tio Cys paling tinggi. Oleh karena itu, yang terbesar nilai praktis dalam analisis kualitatif dan kuantitatif asam -amino, termasuk dalam penganalisis asam amino, menerima reaksi ninhidrin universal, spesifik untuk keberadaan simultan gugus amino dan karboksi pada atom -C.

Beras. 3.3. Rumus umum struktur asam -amino dan produk polimerisasinya. Penjelasan dalam teks.

Polimerisasi asam -amino ke dalam struktur peptida dan protein (Gbr. 3.3) mempertahankan semua jenis R-nya, tetapi:

1. Reaksi ninhidrin menjadi negatif, karena dengan pengecualian terminal N dan C, gugus -amino dan -karboksi digunakan untuk pembentukan ikatan peptida. Reaksi ninhidrin positif dengan protein lebih menunjukkan adanya pengotor asam amino dalam sediaan atau piring.

2. Untuk semua peptida dan protein, reaksi biuret terhadap gugus peptida, yang tidak ada dalam asam amino monomer, bersifat spesifik.

3. Dari reaksi yang lebih spesifik terhadap asam amino R, berikut ini berguna: reaksi xantoprotein dengan asam nitrat pekat, menjadi aromatik R Phe, Tyr, Tri; reaksi dengan isatin untuk cincin beranggota lima Pro, serta reaksi untuk imidazol R His, gugus tio Cys, dan gugus guanidino Arg. Penting untuk mempertimbangkan bahwa beberapa dari Rs ini tersembunyi di dalam butiran protein, dan oleh karena itu, reaksi kualitatif terhadapnya melemah. Oleh karena itu, sebelum dilakukan, protein biasanya didenaturasi dengan satu atau lain cara.

4. Tidak seperti larutan asam amino sejati, larutan koloid protein dicirikan oleh: reaksi sedimentasi terkait dengan penghancuran cangkang hidrasi mereka dan, sebagai akibatnya, penurunan kelarutannya di bawah aksi agen penghilang air: garam netral = penggaraman, metanol = MeOH, etanol = EtOH, aseton, urea, dan agen lainnya.

Melakukan reaksi kualitatif, Anda harus:

1. Hati-hati mengikuti aturan keselamatan kebakaran dan bekerja dengan asam pekat dan alkali = EJ.

2. Tandai 2 baris tabung reaksi dengan glassgraph atau spidol dan tempatkan tidak lebih dari 0,5 ml (2-5 tetes) larutan asam amino 1% di salah satunya, dan larutan protein 1% dengan volume yang kira-kira sama di lain.

3. Dalam sepasang tabung reaksi dengan larutan asam amino dan protein, tambahkan 3-5 tetes reagen yang sesuai secara paralel dan lakukan sisa prosedur yang ditunjukkan untuk reaksi yang sesuai.

4. Jika perlu memanaskan tabung reaksi, buka tutup wadah dan bakar bahan bakar hingga kering dengan korek api. Kemudian, jepit tabung reaksi ke dalam dudukannya, yang desain primitifnya sangat tidak dapat diandalkan. Oleh karena itu, lebih baik untuk membungkus sepasang tabung reaksi dengan selembar kertas yang dilipat menjadi strip dan, memegangnya ibu jari, melewati bagian bawah tabung reaksi secara merata melalui nyala api, menghindari arah leher pada tetangga dan larutan yang mendidih dengan cepat. Setelah menyelesaikan operasi, matikan api tepat waktu dengan tutup wadah.

5. Hasil percobaan, sesuai dengan template, menyusun tentang penyebaran buku catatan laboratorium dalam bentuk tabel:

6. Setelah mempertimbangkan hasil dan, setelah menyelesaikan protokol, bersama dengan rak tabung reaksi, berikan kepada guru untuk perlindungan.

1. Reaksi ninhidrin. Berdasarkan deaminasi dan dekarboksilasi asam -amino dengan larutan alkohol ninhidrin:

Amonia yang dihasilkan, bereaksi dengan dua molekul ninhidrin, membentuk turunan berwarna dengan serapan maksimum pada 540 nm (untuk Pro - 440 nm).

Proses kerja: Tambahkan 3-5 tetes larutan alkohol 0,5% ninhidrin ke dalam sampel yang diteliti. Panaskan perlahan tabung reaksi dengan campuran di atas api dan setelah 2-3 menit catat penampakan warnanya.

2. Reaksi xantoprotein. Seperti disebutkan di atas, ini didasarkan pada pembentukan turunan nitro asam amino dengan aromatik R: Phen, Tyr, Tri.

Proses kerja: Menghidupkan lemari asam, dengan hati-hati tambahkan beberapa tetes asam nitrat pekat (HNO 3) ke sepasang tabung reaksi dengan larutan uji. Panaskan tabung reaksi dengan hati-hati di atas api, hindari arah leher ke tetangga, dan catat perkembangan warnanya.

3. Reaksi nitroprusida. Ini didasarkan pada hidrolisis alkali sistein asam amino yang mengandung sulfur, dengan pelepasan natrium sulfida (Na 2 S), yang memberikan kompleks merah dengan larutan natrium nitroprusida yang baru disiapkan.

Proses kerja: Tambahkan volume yang sama dari 20% natrium hidroksida ke kedua tabung reaksi dengan 5-10 tetes larutan uji dan didihkan setidaknya selama 3-5 menit. Tambahkan 3-5 tetes larutan natrium nitroprusida ke dalam tabung reaksi dan catat perkembangan warna.

4. Reaksi biuret. Ini didasarkan pada pembentukan dalam media basa kompleks berwarna dari ikatan peptida dengan ion Cu2+. Berfungsi sebagai tes universal untuk mendeteksi peptida dan protein dalam larutan. Karena dengan peningkatan jumlah ikatan peptida, intensitas warna larutan meningkat secara linier, ini banyak digunakan untuk penentuan konsentrasi protein secara fotometrik.

Proses kerja. Tambahkan larutan natrium hidroksida 10% dalam jumlah yang sama ke dalam tabung reaksi dengan 5-10 tetes larutan uji. Aduk rata dan tambahkan 2 tetes larutan tembaga sulfat 1% (CuSO 4). Campur sampel dan setelah beberapa menit, catat perkembangan warna.

5. Uji dengan merebus. Berdasarkan denaturasi termal protein.

Proses kerja. Asamkan kedua tabung reaksi dengan larutan uji dengan tidak lebih dari satu tetes larutan asam asetat (AcOH) 1% dan panaskan hingga mendidih. Setelah mendidihkan larutan selama 2-3 menit, catat hasilnya dan jelaskan mekanisme fenomena tersebut.

6. Pengendapan dengan garam logam berat(Aku) . Sifat denaturasinya didasarkan pada kemampuan kation Me berat untuk bereaksi dengan gugus fungsi R dari molekul protein: tio-, amino-, karboksi-, aromatik. Juga, anion kuat mereka menyebabkan pengisian kembali kelompok ionogenik dalam molekul protein, sehingga menghancurkan ikatan ionik di dalamnya.

Proses kerja. Tambahkan beberapa tetes larutan 5% tembaga sulfat (CuSO 4) ke kedua tabung reaksi dengan larutan uji. Catat dan jelaskan hasilnya.

7. Pengendapan dengan asam organik. Ini didasarkan pada denaturasi asam protein dan pembentukan turunan kovalen dari gugus tio-, amino- dan aromatik dari asam amino R dengan organoklorin.

Proses kerja. Tambahkan beberapa tetes larutan 10% asam trikloroasetat (TCA) ke tabung reaksi dengan larutan uji dan catat hasilnya dalam beberapa menit

Artikel ini akan mempertimbangkan metode untuk menentukan asam amino, yang digunakan tidak hanya dalam analisis produk, tetapi juga dalam analisis biokimia dan farmasi.

Jumlah total asam amino dapat dilakukan dengan metode fotometrik berdasarkan penentuan amonia yang diperoleh dari asam amino menurut metode Kjeldahl.

Reaksi dengan 1-naftol. Untuk menentukan arginin, histidin, tirosin, reaksi dengan 1-naftol diusulkan. Dengan adanya natrium hipoklorit (NaOCl), larutan berubah menjadi merah. Larutan sampel dalam etanol 50% yang mengandung asam amino didinginkan dengan es dan larutan NaOCl 10% dan larutan naftol ditambahkan. Produk reaksi berwarna merah (l maks = 550 nm). Kandungan asam amino ditentukan oleh intensitas warna larutan yang dihasilkan.

Reaksi biuret. Salah satu reaksi terpenting yang digunakan untuk menentukan asam amino adalah reaksi biuret. Reaksi dilakukan dengan menambahkan larutan encer garam tembaga (II) ke dalam larutan basa biuret. Dalam hal ini, solusinya diwarnai dengan intens ungu karena pembentukan senyawa kompleks.

Senyawa yang mengandung setidaknya 2 gugus amida atau gugus aminohidroksietilen, serta amida dan imida asam amino masuk ke dalam reaksi biuret. Protein dan larutan pekat asam amino dan amida memberikan reaksi ini. Larutan encer asam amino tidak memberikan reaksi biuret dan oleh karena itu reaksi tersebut dapat digunakan untuk menentukan akhir hidrolisis protein. Reaksi ini juga digunakan untuk penentuan kualitatif dan kuantitatif protein. Metode yang digunakan di laboratorium diagnostik klinis untuk menentukan protein dalam darah dan cairan biologis lainnya didasarkan pada reaksi biuret.

reaksi ninhidrin. Reaksi terpenting kedua yang digunakan untuk menentukan asam amino adalah reaksi ninhidrin - reaksi warna untuk asam a-amino, yang dilakukan dengan memanaskan yang terakhir dalam larutan alkali ninhidrin berlebih.

Ninhidrin melakukan dekarboksilasi oksidatif asam a-amino dengan pembentukan amonia, karbon dioksida dan aldehida yang mengandung satu atom karbon kurang dari asam amino asli. Ninhidrin tereduksi kemudian bereaksi dengan amonia yang dilepaskan dan molekul ninhidrin kedua, membentuk produk kondensasi berwarna dengan amonia.

Senyawa yang dihasilkan (pigmen) memiliki warna ungu-biru (l max = 570 nm). Pembentukan senyawa berwarna ini digunakan dalam uji kuantitatif untuk asam a-amino, yang dengannya asam amino dapat dideteksi, bahkan jumlahnya tidak melebihi 1 g.

Prolin dan hidroksiprolin, yang tidak memiliki gugus a-amino, bereaksi dengan ninhidrin untuk membentuk turunan warna kuning(l maks = 440 nm). Reaksinya tidak spesifik, karena produk berwarna dengan ninhidrin juga menghasilkan amonia dan senyawa yang mengandung gugus amino (amina, protein, peptida). Namun, tidak ada CO2 yang dilepaskan dengan senyawa ini. Pelepasan karbon dioksida adalah karakteristik hanya untuk asam a-amino. Reaksi ini digunakan untuk penentuan kuantitatif kolorimetri asam amino, termasuk dalam analisa asam amino otomatis (pengukuran volume CO2).

Reaksi ninhidrin digunakan untuk menentukan glisin, isoleusin, leusin; warna kurang intens diberikan oleh serin, fenilalanin, sistein, tirosin, triptofan, dll.

Produk yang dihasilkan dicirikan oleh warna yang cukup intens (e = 1,8–3,3 10 4), tetapi produk berwarna tidak stabil. Intensitas warna menurun dengan cepat. CdCl2 ditambahkan untuk stabilisasi. Ini membentuk kompleks yang stabil dengan senyawa yang dihasilkan. Kadmium klorida juga mempercepat reaksi.

Asam amino dan beberapa senyawa lain yang mengandung gugus amino mengembun dalam media basa dengan 1,2-naphthoquinone - 4-sulfoxylate untuk membentuk turunan berwarna merah, kuning, oranye dari 1,2-naphthoquinone monoimine.

Reaksi ini digunakan untuk menentukan asam a-amino (valin, isoleusin, leusin, dll.).

Reaksi dengan 4-dimetilaminobenzaldehida dapat digunakan untuk menentukan triptofan. Produk reaksi berwarna ungu dan intensitas warna menentukan kandungan triptofan dalam larutan yang dianalisis.

Perlu dicatat, bagaimanapun, bahwa reaksi ini jarang digunakan dalam analisis makanan.

Untuk penentuan kuantitatif asam amino yang mengandung belerang, digunakan metode bromatometrik, berdasarkan reaksi berikut:

Larutan sistein dalam larutan NaOH 1% dituangkan ke dalam labu dengan ground stopper 0,1 N. larutan kalium bromat, kalium bromida kering dan diasamkan dengan HCl 10%.

BrO 3 - + 5Br - + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O

Brom yang terbentuk sebagai hasil reaksi, yang jumlahnya setara dengan jumlah kalium bromat, bereaksi dengan asam amino. Setelah 10 menit, kalium iodida ditambahkan, yang bereaksi dengan brom yang tidak bereaksi, dan yodium yang dilepaskan dititrasi dengan 0,1 N. larutan natrium tiosulfat dengan kanji sebagai indikator.

2I - + Br 2 → Br - + I 2

Jumlah tiosulfat yang digunakan untuk titrasi setara dengan jumlah brom yang tidak bereaksi dengan asam amino. Dengan perbedaan antara jumlah kalium bromat dan tiosulfat yang ditambahkan, jumlah brom yang bereaksi dengan asam amino ditemukan, dan karenanya jumlah asam amino.

Metionin ditentukan dengan cara yang sama. Metionin dioksidasi menjadi sulfon:

Reaksi ini, dalam kondisi tertentu, memungkinkan Anda menentukan kandungan metionin dengan sangat akurat.

Metode untuk menentukan asam amino

Asam amino secara biologis zat aktif, mereka memainkan peran penting dalam kehidupan tubuh manusia, mereka banyak digunakan sebagai obat. Beberapa dari mereka sangat diperlukan dan masuk ke dalam tubuh dengan makanan. Saat ini, ada beberapa metode untuk penentuan kuantitatif asam amino dalam bahan tanaman obat, antara lain: obat dan cairan biologis, dalam produk makanan.

Dari berbagai macam metode untuk penentuan kuantitatif asam amino dalam berbagai objek, empat kelompok utama dapat dibedakan: metode analisis kromatografi, spektrofotometri, titrimetri, dan elektrokimia.

Metode Kromatografi

Selama beberapa dekade terakhir, kemajuan signifikan telah dibuat di bidang kromatografi gas-cair asam amino. Sebuah metode menggunakan kolom micropacked diusulkan, yang memungkinkan untuk relatif waktu yang singkat untuk memisahkan hampir sepenuhnya 17 asam amino yang penting secara biologis.

Sebuah metode telah dikembangkan untuk penentuan asam amino menggunakan kromatografi gas-cair dalam sampel serum, plasma, urin dan cairan serebrospinal, berdasarkan preparasi 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoil-isobutil eter, diikuti oleh pemisahan pada kolom polidimetilsiloksan dalam mode pemrograman suhu dari 140 ° C hingga 250 ° C dengan detektor ionisasi nyala. Waktu pemisahan kromatografi adalah 28 menit. Sebagai hasil penelitian, dimungkinkan untuk memisahkan 27 asam amino.

Terlepas dari berbagai metode kromatografi cair kinerja tinggi dalam analisis asam amino, versi fase terbalik dengan deteksi spektrofotometri adalah yang paling ekspresif dan mudah diakses. Untuk pemisahan dan deteksi yang berhasil, asam amino diubah menjadi turunan hidrofobik dan penyerap cahaya, yaitu, derivatisasi pra-kolom dilakukan. Sebagai reagen untuk derivatisasi, ortoftalaldehida, naftalena-2,3-dikarboksialdehida, 9-fluorenilmetilkloroformat digunakan.

Sebuah metode untuk penentuan kuantitatif L-sistin, asam L-glutamat dan glisin dalam obat Eltacin, yang memiliki aktivitas antioksidan dalam kombinasi dengan efek antiangina, telah dikembangkan. Asam glutamat dan glisin ditentukan dengan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik setelah derivatisasi pra-kolom dengan reagen ortoftalaldehid/N-asetil-L-sistein. Derivatisasi sistein, menurut penulis, sulit karena ketidakstabilan asam amino itu sendiri dan turunan yang dihasilkan. Oleh karena itu, analisis sistein dilakukan dengan metode titrasi bromatometri. Ditemukan bahwa kehadiran sejumlah besar sistein dalam sampel tidak mengganggu penentuan produk derivatisasi glisin dan asam glutamat dengan reagen ortoftalaldehid / N-asetil-L-sistein. Metode ini ditandai dengan reproduktifitas tinggi dan akurasi penentuan.

Kemungkinan menggunakan 4,7-phenanthroline-5,6-dione (fanquinone) sebagai reagen-label fluorogenik untuk pembentukan pra-kolom turunannya untuk pemisahan dan analisis kuantitatif asam amino dengan kromatografi cair kinerja tinggi telah dipelajari. Tidak memiliki fluoresensi sendiri, phanquinone bereaksi dengan gugus amino asam amino (pada 68 °C selama 160 menit), membentuk iminoquinols, fluoresensi yang diukur pada panjang gelombang 460 nm. Turunan hasil isolasi diidentifikasi dengan spektrum Tm, IR, massa, dan PMR. Kromatografi cair kinerja tinggi dilakukan pada kromatografi dengan detektor fluoresen dan kolom dengan elusi gradien dengan campuran: larutan trietilamina - buffer fosfat (pH 3) - metanol. Quinidine digunakan sebagai standar internal. Metode ini cukup menjanjikan dalam kondisi laboratorium besar dan dapat diusulkan untuk analisis asam amino dalam bentuk sediaan jadi.

Sebuah teknik untuk kromatografi cair kinerja tinggi dengan biosensor potensiometri untuk penentuan kuantitatif lisin telah dikembangkan. Biosensor dibangun dengan menempelkan membran yang mengandung lisin oksidase ke elektroda NH4+ selektif ion. Ion amonium yang dihasilkan selama degradasi enzimatik lisin dideteksi secara potensiometri. Metode ekspres kromatodensitometri untuk analisis triptofan dalam cairan kultur telah dikembangkan. Kromatografi lapis tipis dilakukan pada pelat Sorbfil. Kromatografi dilakukan dalam sistem propanol-2 - larutan amonium hidroksida 25% (7:3) selama 25 menit. Kromatogram dikeringkan pada suhu kamar dan disimpan pada 120 ° C selama 15 menit. Untuk mendeteksi bercak pada kromatogram, digunakan reagen spesifik - 4-dimetilaminobenzaldehida, selektif terhadap cincin indol triptofan, dalam bentuk larutan etanol 0,5% dengan penambahan asam sulfat pekat 5%. Setelah mengembangkan kromatogram dengan perendaman dalam kuvet Teflon dengan larutan 4-dimetilaminobenzaldehida yang baru disiapkan, disimpan selama 5-7 menit pada suhu 110°C. Bintik triptofan dipindai pada panjang gelombang 625 nm menggunakan densitometer video komputer. Metode yang dikembangkan, terlepas dari akurasi penentuan dan produktivitas yang tinggi, khusus untuk triptofan.

Untuk analisis asam -amino dalam cairan biologis, obat-obatan, dan produk makanan, metode elektroforesis kapiler banyak digunakan, berdasarkan pemisahan komponen campuran kompleks dalam kapiler kuarsa di bawah aksi medan listrik yang diterapkan. Karena asam amino bersifat zwitterionik, mereka dapat dipisahkan menggunakan buffer elektrolit dengan pH yang sesuai, biasanya buffer pemisahan netral dan basa digunakan.

Untuk meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas metode elektroforesis kapiler untuk analisis asam -amino individu, derivatisasi awal digunakan, diikuti dengan pemisahan dalam kapiler kuarsa dan penentuan spektrofotometri produk reaksi. Jadi, 9-fluorenilmetil format, 9-(2-karbazol)-etil kloroformat, dan pewarna sianin digunakan sebagai zat penderivat. Prospek metode ini karena keunggulannya seperti analisis yang cepat, kemudahan preparasi sampel, konsumsi reagen yang rendah, dan kemudahan instrumentasi.