Penentuan vitamin A secara kualitatif dan kuantitatif. Masalah modern ilmu pengetahuan dan pendidikan. Sistem antioksidan non-enzimatik
Dengan kajian mendalam tentang proses produksi konsentrat pangan dan pengeringan sayuran, saat didirikan nilai gizi produk jadi, serta ketika memantau produksi produk yang diperkaya, tentukan kandungan vitamin berikut di dalamnya: vitamin C ( asam askorbat), B1 (tiamin), B2 (riboflavin), PP (asam nikotinat), karoten (provitamin A).
Persiapan sampel untuk penentuan vitamin. Sampel produk uji disiapkan segera sebelum dianalisis. Saat menganalisis buah-buahan dan sayuran segar, sampel dalam bentuk segmen memanjang dipotong dari spesimen individu dengan pisau baja tahan karat, yang dengan cepat dicincang dengan pisau (kubis, bawang bombay) atau di parutan (kentang, umbi-umbian), diaduk rata. dan diambil sampel paling sedikit 200 dari massa homogen yang dihasilkan d, yang segera dikirim untuk penelitian.
Berry segar dan buah-buahan kecil yang berair tidak dipotong terlebih dahulu; dari rata-rata sampel diambil ke dalam toples tempat yang berbeda beberapa buah beri dan buah-buahan sekaligus, campurkan dan ambil sampel untuk dianalisis. Bijinya dikeluarkan dari buah dan buah beri yang berbiji, lalu dilanjutkan seperti dijelaskan di atas.
Buah-buahan dan sayuran kering minimal 50 g dihancurkan di gilingan laboratorium atau dengan gunting dan bahan hancur yang dihasilkan dituangkan ke dalam toples dengan ground stopper. Sampel diambil dari massa yang tercampur rata untuk analisis laboratorium.
Konsentrat makanan dalam jumlah minimal 200 g dihancurkan di pabrik laboratorium, dicampur dan diambil sampelnya untuk dianalisis.
Konsentrat makanan susu yang diperkaya (dalam bentuk briket) minimal 100 g dihancurkan dan digiling dalam mortar, diaduk rata dan diambil sampelnya untuk dianalisis.
Produk bubuk dalam jumlah minimal 50 g dicampur secara menyeluruh sebelum pengambilan sampel untuk penelitian.
Saat mempelajari produk cair, bubur, dan seperti pasta, sampel untuk analisis diambil setelah sampel tercampur rata.
Penentuan Vitamin C
Vitamin C, asam l-askorbat (C6H8O6), dapat ditemukan di produk makanan dalam dua bentuk: tereduksi dan teroksidasi (asam dehidroaskorbat).
Kuantitatif metode kimia Definisi asam askorbat didasarkan pada sifat pereduksinya. Cara utama untuk menentukan kandungan asam askorbat dalam obat dan produk makanan adalah titrasi indofenol atau iodometri. Reagen indofenol yang digunakan adalah 2,6-diklorofenolindofenol, berwarna biru, bila dititrasi, asam askorbat tereduksi dan menjadi senyawa leuko yang tidak berwarna. Selesainya reaksi dinilai dari warna larutan uji di dalamnya warna merah jambu disebabkan oleh kelebihan indikator, yang dalam lingkungan asam berwarna merah muda. Jumlah indofenol yang digunakan untuk titrasi menentukan kandungan vitamin C dalam produk. Untuk titrasi iodometri digunakan larutan kalium iodat, pati berfungsi sebagai indikator.
Saat menentukan vitamin C dalam produk makanan, metode titrasi indofenol digunakan: arbitrase, menggunakan hidrogen sulfida dan kontrol (disederhanakan). Pilihan metode tergantung pada sifat produk yang diteliti dan tujuan analisis.
Metode arbitrase (indofenol menggunakan hidrogen sulfida)
Sampel produk yang diteliti adalah 10-50 g, tergantung pada kandungan vitamin C yang diharapkan, diambil dengan ketelitian 0,01 g, secara kuantitatif menggunakan larutan 5%. asam asetat dipindahkan ke labu takar (atau silinder) dan dengan asam yang sama isi labu diatur hingga volume 50-100 ml. Saat menganalisis konsentrat dan sayuran serta buah-buahan kering, sampel 5-10 g digiling dalam mortar dengan 5-10 g bubuk kaca atau pasir kuarsa (sebelumnya dibersihkan dari kotoran besi, dicuci dan dikalsinasi) dan dengan jumlah tiga kali lipat. larutan 5% relatif terhadap sampel asam asetat. Saat menggiling, produk yang dianalisis harus seluruhnya dilapisi dengan asam asetat. Campuran yang telah digiling seluruhnya dibiarkan dalam mortar agar meresap selama 10 menit, setelah itu isi mortar dituangkan ke dalam labu takar (atau silinder) melalui corong, hati-hati jangan sampai memindahkan sedimen. Mortar, corong dan tongkat dibilas beberapa kali dengan larutan asam asetat 5%, setiap kali endapan dibiarkan mengendap. Cairan pencuci dituangkan ke dalam larutan uji dalam labu ukur (atau silinder) dan disesuaikan dengan volume 50-100 ml, tergantung pada ukuran sampel yang diambil dan kandungan vitamin C yang diharapkan.Isi labu takar atau silinder tercampur rata dan disentrifugasi atau disaring dengan cepat melalui lapisan kapas.
Ekstrak asam asetat yang dihasilkan sebanyak 10 ml dipipet ke dalam labu, gelas atau tabung centrifuge berkapasitas 60-80 ml dan ditambahkan 0,4 g kalsium karbonat serta 5 ml larutan 5% secara berurutan, sambil dikocok perlahan, hingga terbentuk pH yang diperlukan dan klarifikasi larutan timbal asetat yang dibuat dalam larutan asam asetat 5%. Operasi ini harus dilakukan dengan hati-hati, karena penambahan kalsium karbonat disertai dengan pembentukan busa. Solusinya dengan cepat disentrifugasi atau disaring ke dalam labu kering melalui filter terlipat kecil yang telah disiapkan sebelumnya.
Jika filtratnya keruh, klarifikasi diulangi dengan menggunakan bagian lain dari ekstrak asam asetat dari produk yang dianalisis. Tambahkan ke dalamnya kalsium karbonat dalam jumlah 2, 3 atau 4 kali lipat dan larutan timbal asetat 5%, lalu saring atau sentrifugasi seperti yang ditunjukkan di atas. Aliran hidrogen sulfida, diperoleh dari peralatan Kipp melalui aksi asam klorida encer (1:1) atau asam sulfat (1:3) pada besi sulfida, dilewatkan melalui filtrat transparan selama 5-15 menit. Untuk mengendapkan timbal sulfida dengan cepat dan sempurna, larutan dikocok kuat-kuat pada awal pelepasan hidrogen sulfida. Pengeluaran hidrogen sulfida selesai ketika lapisan cairan di atas endapan hitam timbal sulfida menjadi transparan. Larutan disaring melalui filter kecil tanpa abu kering ke dalam labu kering dan hidrogen sulfida dihilangkan seluruhnya dari filtrat transparan menggunakan arus karbon dioksida dari silinder atau peralatan Kipp yang diisi dengan marmer dan asam klorida encer (1:1). Karbon dioksida dapat digantikan dengan nitrogen. Kelengkapan penghilangan hidrogen sulfida dipantau dengan menggunakan kertas saring yang dibasahi dengan larutan timbal asetat, yang dibawa ke leher labu; tanpa adanya hidrogen sulfida, kertas tetap tidak berwarna, munculnya warna kuning-hitam titik di atasnya menunjukkan adanya hidrogen sulfida. Aliran hidrogen sulfida dan gas inert harus dilakukan di lemari asam.
Pertama, pipet 5 ml larutan asam asetat 80% dan air suling secukupnya ke dalam labu sehingga total volume cairan dengan larutan uji adalah 15 ml. Kemudian pipet dari 1 sampai 10 ml larutan uji yang diperoleh setelah menghilangkan hidrogen sulfida, dan titrasi 0,001 N dari mikroburet atau mikropipet. larutan 2,6-diklorofenolindofenol sampai muncul warna merah jambu yang tidak hilang dalam waktu 30-60 detik. Titrasi dilakukan tetes demi tetes sambil terus menerus dikocok perlahan dari larutan yang dititrasi. Titrasi sebaiknya berlangsung tidak lebih dari 2 menit. Setelah titrasi selesai, perlu ditambahkan dua tetes lagi larutan 2,6-diklorofenolindofenol sambil mengocok larutan dengan kuat; jika warna larutan uji meningkat, kita dapat berasumsi bahwa akhir reaksi telah ditemukan dengan benar, dan dalam hal ini volume tetes indikator yang ditambahkan tidak diperhitungkan. Saat menentukan jumlah larutan uji yang diperlukan untuk titrasi, diasumsikan bahwa tidak lebih dari 2 ml 0,001 N yang digunakan untuk titrasi. larutan 2,6-diklorofenolindofenol.
Penentuan vitamin C dilakukan minimal dua kali, dan hasil titrasi paralel tidak boleh berbeda lebih dari 0,04 ml. Kandungan vitamin C dihitung sebagai rata-rata aritmatika dari 2-3 penentuan paralel. Saat menghitung hasil titrasi, harus dilakukan koreksi untuk penentuan kontrol: titrasi 0,001 n. larutan 2,6-diklorofenolindofenol, campuran 5 ml asam asetat 80% dan 10 ml air suling hingga muncul warna merah jambu. Koreksi ini, biasanya sebesar 0,06-0,08 ml untuk volume 15 ml, dikurangi dari jumlah total indikator yang digunakan untuk titrasi larutan uji.
dimana V adalah besarnya 0,001 n. larutan 2,6-diklorofenolindofenol yang digunakan untuk titrasi, dengan memperhatikan koreksi titrasi kontrol, ml; K - faktor konversi tepat 0,001 n. larutan 2,6-diklorofenolindofenol; V1 adalah volume sampel yang dibawa ketika cairan ekstraksi ditambahkan ke dalamnya, ml; V2 adalah volume cairan analisis yang diambil untuk titrasi, ml; V3 adalah volume larutan atau ekstrak awal yang diambil untuk dianalisis setelah penambahan timbal asetat, ml; V4 adalah volume larutan atau ekstrak awal yang diambil untuk dianalisis sebelum diolah dengan timbal asetat; g—berat produk, g; 0,088 - jumlah asam askorbat yang sesuai dengan 1 ml tepat 0,001 n. larutan 2,6-diklorofenolindofenol.
Pengujian vitamin C sebaiknya tidak dilakukan di bawah sinar matahari langsung. Durasi analisis tidak boleh lebih dari 1 jam.
Persiapan 0,001 n. larutan indikator 2,6-diklorofenolindofenol
Kocok 0,25-0,3 g indikator dalam labu ukur satu liter dengan 600 ml air suling selama 1,5-2 jam (bisa dibiarkan larut semalaman), tambahkan air suling hingga 1 liter, aduk rata dan saring. Solusi indikator cocok untuk analisis dalam waktu 5-10 hari. Itu harus disimpan di tempat gelap, di tempat sejuk, sebaiknya di lemari es.
Titer indikator diperiksa setiap hari. Munculnya warna kotor pada pemeriksaan titer menunjukkan bahwa larutan indikator tidak layak untuk dianalisis.
Penentuan titer larutan indikator - 2,6-diklorofenolindofenol
Titer larutan indikator dapat diatur dengan dua cara.
Cara pertama. Ke dalam 5 ml larutan indikator tambahkan 2,5 ml larutan natrium oksalat jenuh dan titrasi dengan 0,01 N dari mikroburet. Larutan garam Mohr dibuat pada 0,02 N. larutan asam sulfat sampai warna biru hilang dan warna kehijauan kebiruan berubah menjadi kuning kuning. Titer larutan garam Mohr ditetapkan sebesar 0,01 N. larutan kalium permanganat, dan titernya adalah 0,01 N. larutan natrium oksalat atau asam oksalat menurut metode yang berlaku umum.
Larutan garam Mohr tetap dapat digunakan untuk analisis selama 2-3 bulan bila disimpan di tempat sejuk dan gelap. Titer larutan garam Mohr diperiksa minimal sebulan sekali.
Cara kedua. Beberapa kristal asam askorbat (kira-kira 1-1,5 mg) dilarutkan dalam 50 ml larutan asam sulfat 2%. 5 ml larutan ini, diambil dengan pipet, dititrasi dengan larutan 2,6-diklorofenolindofenol dari mikroburet sampai muncul warna merah jambu yang tidak hilang dalam waktu 3 menit. Secara paralel, larutan asam askorbat dengan volume yang sama (5 ml) dititrasi dari mikroburet lain hingga tepat 0,001 N. larutan kalium asam iodat (0,3568 g KJO3, dikeringkan selama 2 jam pada suhu 105°C, dilarutkan dalam 1 liter air suling, hasil larutan KJO3 0,01 N diencerkan 10 kali dalam labu takar dengan air suling sebelum dianalisis ). Titrasi dilakukan dengan adanya beberapa kristal (1-2 mg) kalium iodida dan 2-3 tetes larutan kanji 1% sampai muncul warna biru. Titrasi ini dapat dengan mudah dilakukan dalam cawan porselen.
Titer larutan 2,6-diklorofenolindofenol (x) terhadap asam askorbat dihitung menggunakan rumus
dimana V adalah besarnya 0,001 n. Larutan KJO3 yang digunakan untuk titrasi larutan asam askorbat, ml; V1 adalah banyaknya larutan 2,6-diklorofenolindofenol yang digunakan untuk titrasi larutan asam askorbat, ml; 0,088 - jumlah asam askorbat yang sesuai dengan 1 ml tepat 0,001 n. larutan 2,6-diklorofenolindofenol, mg.
Kontrol metode yang disederhanakan untuk menentukan vitamin C
Metode ini digunakan untuk analisis massal buah-buahan dan sayuran segar. Hal ini memungkinkan penentuan asam askorbat hanya dalam bentuk tereduksinya. Keakuratan metode ini ±20%.
Metode penentuan. Tergantung pada kandungan vitamin C yang diharapkan dalam produk, ambil 10-30 g sampel ke dalam gelas yang ditimbang dan segera tuangkan 50 ml larutan asam klorida 4% ke dalamnya; sampel yang diisi asam dapat disimpan selama 10-15 menit. Sampel bersama dengan asam dipindahkan ke mortar porselen. Sebagian asam dari mortar dituangkan ke dalam labu ukur atau silinder 100 ml, dan sampel dengan sedikit sisa asam digiling seluruhnya. Kemudian isi mortar dipindahkan ke silinder (atau labu) yang sama di mana sisa asam klorida berada, mencuci sisa mortar porselen dengan air suling ke dalam labu takar (atau silinder) yang sama. Larutan dalam labu takar ditepatkan dengan air suling sampai tanda batas. Isi labu tercampur rata dan segera disaring melalui kain kasa atau air. Sampel diambil dari larutan ini untuk titrasi.
Jika produknya sulit digiling, tambahkan 2-5 g pasir kuarsa atau bubuk kaca yang telah ditimbang, dicuci bersih, dan dikalsinasi ke dalam sampel dalam mortar porselen. Setelah seluruh isi mortar dipindahkan ke labu takar (atau silinder) dan volume ekstrak menjadi 100 ml, ditambahkan air suling ke dalam ekstrak sebanyak 0,35 ml untuk setiap gram pasir yang diambil. seluruh cairan tercampur rata kembali.
Pada pemeriksaan suatu bahan cair, diencerkan dalam silinder dengan larutan asam klorida 4% dan air suling sehingga konsentrasi akhir asam klorida adalah 2%. Asam klorida dapat diganti dengan asam metafosfat atau oksalat. Untuk mendapatkan ekstrak, gunakan larutan asam metafosfat 2% yang dibuat dalam 2 N. larutan asam sulfat. Pertama, siapkan larutan asam metafosfat 20% dalam 2 N. larutan asam sulfat, dan sebelum digunakan larutan ini diencerkan 10 kali dengan 2 N. larutan asam sulfat.
Sampel produk uji digiling dalam mortar dengan larutan asam metafosfat 2% (sampel harus dilapisi dengan asam), kemudian dipindahkan ke silinder ukur. Mortar dicuci beberapa kali dengan sedikit larutan asam metafosfat, larutan ini dituangkan ke dalam silinder, sehingga isinya menjadi 100 ml. Vitamin C dalam larutan asam metafosfat stabil selama beberapa jam. Dengan tidak adanya asam metafosfat, asam oksalat dapat digunakan. Contoh bahan uji digiling cepat dalam mortar dengan 20 ml larutan asam klorida 1% kemudian isi mortar porselen dipindahkan ke dalam gelas ukur berkapasitas 100 ml dan volume ekstraknya adalah. disesuaikan menjadi 100 ml menggunakan larutan 1%. asam oksalat. Setelah diaduk, ekstraknya disaring. Untuk titrasi 0,001 N. Dengan larutan 2,6-diklorofenolindofenol, ekstrak yang disaring diambil tidak lebih dari 5 ml.
Titrasi dan penghitungan kandungan vitamin C (dalam miligram per 100 g produk) dilakukan dengan cara yang sama seperti metode arbitrase. Perbedaan hasil analisis dua sampel paralel dari produk yang sama tidak boleh melebihi 3-4%.
Metode penentuan vitamin C dalam makanan kering sulfat
Metode ini didasarkan pada fakta bahwa senyawa belerang (dalam lingkungan asam) diblokir oleh formaldehida dan tidak mengganggu titrasi asam askorbat.
Sebagian produk kering yang ditimbang, diambil sedemikian rupa sehingga ekstraknya mengandung 0,04-0,1 mg vitamin C, digiling dalam mortar dengan larutan asam metafosfat 5%. Ekstrak disaring dan, dalam hal mempelajari produk non-sulfat, dititrasi hingga 0,001 N. larutan 2,6-diklorofenolindofenol.
Saat menganalisis produk kering sulfat, ekstrak metafosfat yang dihasilkan diasamkan dengan larutan asam sulfat 50% dan diolah dengan formaldehida, yang konsentrasinya dalam larutan akhir harus 4%. Larutan didiamkan selama 8 menit kemudian dititrasi dengan 0,001 N. larutan 2,6-diklorofenolindofenol seperti di atas.
Penentuan karoten
Metode untuk menentukan karoten didasarkan pada ekstraksi dari jaringan tanaman dengan bensin atau petroleum eter dan pelepasan selanjutnya dari zat yang menyertainya menggunakan kromatografi adsorpsi. Penentuan kuantitatif karoten dilakukan dengan kolorimetri dari larutan yang dihasilkan mengandung karoten. Tiga varian metode telah diusulkan untuk penentuan karoten.
Metode penentuan. Pilihan pertama. Karoten diekstraksi dari bahan tanaman setelah didehidrasi dengan alkohol atau aseton, kemudian zat yang menjadi ekstrak disabunkan dengan larutan alkali beralkohol. Karoten diekstraksi kembali, filtratnya dilewatkan melalui kolom adsorpsi, dan kemudian ditentukan intensitas warna filtratnya.
Sampel produk yang dihancurkan diambil dalam jumlah 1 hingga 50 g, tergantung pada kandungan karotennya, dan digiling dalam mortar porselen dengan sedikit pasir yang dicuci dan dikalsinasi atau kaca yang dihancurkan. Tambahkan alkohol atau aseton lima kali lebih banyak ke massa bubuk dalam mortar, giling, lalu tambahkan 20-30 ml bensin atau petroleum eter dalam porsi. Campuran digiling, ekstrak disaring melalui kertas saring; ekstraksi diulangi sampai bagian terakhir ekstrak menjadi tidak berwarna.
Filtrat dipindahkan ke corong pisah, beberapa mililiter air suling ditambahkan untuk memisahkan lapisan: lapisan atas adalah bensin, lapisan bawah adalah alkohol atau aseton. Lapisan alkohol atau aseton dituangkan ke dalam corong pemisah lainnya dan dicuci 2 kali dengan bensin atau petroleum eter, menambahkan ekstrak ini ke dalam filtrat utama. Ekstrak gabungan dipindahkan ke dalam labu dan dipekatkan hingga volume 20-30 ml dalam penangas air pada suhu tidak melebihi 50 ° C dalam ruang hampa. Volume alkali alkohol 5% yang kira-kira sama ditambahkan ke dalam ekstrak dan disabunkan selama 30 menit-1 jam dalam penangas air dengan refluks saat larutan mendidih. Larutan hasil saponifikasi dipindahkan ke corong pisah, ditambahkan beberapa mililiter air, dikocok dan lapisan bensin dipisahkan, kemudian dicuci 8-10 kali dengan air suling. Ekstrak bensin dipindahkan ke dalam labu dan dikeringkan dengan natrium sulfat anhidrat sambil dikocok sampai kekeruhan larutan hilang, kemudian disaring dan dipekatkan hingga volume 5-10 ml seperti disebutkan di atas. Ekstrak kental dilewatkan pada tekanan rendah melalui kolom adsorpsi yang diisi dengan magnesium oksida atau aluminium oksida. Karoten yang teradsorpsi pada kolom dielusi (dilarutkan) dengan eter atau bensin, dilewatkan melalui adsorben hingga cairan yang keluar dari kolom menjadi tidak berwarna.
Filtrat yang dihasilkan ditampung dalam labu takar, volume cairan ditepatkan sampai tanda dengan petroleum eter atau bensin dan dikolorimeterisasi dalam kolorimeter Dubosque atau pada fotoelektrokolorimeter, menggunakan larutan standar azobenzena atau kalium dikromat sebagai perbandingan.
Pilihan kedua. Pertama dilakukan saponifikasi zat uji, kemudian dilakukan ekstraksi karoten, adsorpsi dan kolorimetri. Bagian yang ditimbang dari bahan yang dihancurkan (dari 1 hingga 50 g), digiling dalam mortar, dipindahkan ke dalam labu, ditambahkan 20-40 ml alkohol alkali 5%, disabunkan selama 30 menit-1 jam dan kemudian dilanjutkan dalam caranya sama seperti pada cara pertama.
Opsi ketiga (disederhanakan). Dengan metode ini, saponifikasi dihilangkan, dan semua tahapan analisis lainnya sama seperti metode pertama.
Ekstrak yang dihasilkan dicuci dengan air, dikeringkan dengan natrium sulfat anhidrat, dipekatkan hingga volume kecil, dilewatkan melalui kolom dengan adsorben dan dikolorimeter.
Saat menentukan karoten dalam wortel, penggunaan kolom adsorpsi dapat dikecualikan, karena wortel mengandung sejumlah kecil karotenoid lain, yang praktis tidak banyak berpengaruh pada hasil penentuan. Analisis menurut pilihan ketiga dilakukan dalam hal hasil penentuan karoten bertepatan dengan hasil yang diperoleh saat bekerja menurut pilihan pertama. Penentuan karoten dalam bahan tanaman kering (sayuran, buah-buahan, beri dan produk lainnya). Sampel bahan yang dihancurkan diambil dari 2 hingga 10 g, karoten diekstraksi dengan bensin atau petroleum eter tanpa perlakuan awal dengan alkohol. Ekstrak yang dihasilkan dipekatkan hingga volume 20-30 ml dan disabunkan dengan larutan alkohol KOH. Selanjutnya dilakukan analisis seperti yang ditunjukkan pada opsi pertama.
Perhitungan kandungan karoten. Saat menggunakan kolorimeter Duboscq dan larutan standar azobenzena atau kalium bikromat untuk kolorimetri, kandungan karoten (x) dalam mg% dalam produk uji dihitung menggunakan rumus
di mana K adalah faktor konversi (jumlah karoten dalam miligram yang sesuai dengan 1 ml larutan standar azobenzena adalah 0,00235 atau larutan standar kalium dikromat adalah 0,00208); H - pembacaan skala solusi standar, mm; H1 - pembacaan skala larutan uji, mm; g - bagian yang ditimbang dari produk yang diteliti, g; V adalah volume filtrat setelah adsorpsi kromatografi, ml.
Saat menggunakan elektrofotokolorimeter, gunakan rumus berikut:
dimana H2 adalah pembacaan skala rheochord untuk larutan standar; H1 - sama untuk larutan uji. Notasi selebihnya sama seperti pada rumus sebelumnya.
Persiapan larutan standar
Larutan azobenzena. 14,5 mg azobenzene kristal murni kimia dilarutkan dalam 100 ml etil alkohol 96%.
Larutan kalium bikromat. 360 mg kalium bikromat tiga kali rekristalisasi dilarutkan dalam 1 liter air suling.
Persiapan kolom adsorpsi
Untuk kolom adsorpsi digunakan tabung gelas dengan panjang 12-15 cm, diameter 1-1,5 cm, menyempit ke bawah. Tabung dimasukkan melalui sumbat ke dalam labu Bunsen. DI DALAM bagian bawah kapas dimasukkan ke dalam tabung adsorpsi, kemudian adsorbennya adalah magnesium oksida atau aluminium oksida. Untuk melakukan ini, siapkan bubur dari adsorben dan bensin atau petroleum eter. Kolom diisi hingga 4-6 cm dengan bubur dan dicuci dengan sedikit pelarut, menghindari pembentukan gelembung udara.
Penentuan vitamin B1
Vitamin B1 (tiamin, aneurin) ditemukan dalam produk alami baik dalam bentuk bebas maupun terikat. Dalam kasus pertama, itu adalah tiamin bebas atau kloridanya - hidroklorida (C12H18O4Cl2); dalam keadaan terikat, itu adalah ester tiamin pirofosfat yang dikombinasikan dengan pembawa protein, yaitu. adalah koenzim karboksilase. Metode penentuan vitamin B1 didasarkan pada kemampuan tiamin untuk dioksidasi menjadi tiokrom oleh kalium ferricyanide dalam media basa dan sifat tiokrom yang dihasilkan untuk menghasilkan fluoresensi biru ketika disinari oleh sinar ultraviolet. Selama analisis, tiokrom diekstraksi dari larutan berair-basa dengan isobutil, butil atau isoamil alkohol, sehingga memisahkannya dari fluoresen dan pengotor lain yang tidak diinginkan yang tidak larut dalam alkohol ini.
Kandungan tiamin dalam zat uji ditentukan dengan melakukan penentuan perbandingan intensitas fluoresensi larutan uji dan larutan standar pada fluorometer. Metode yang dijelaskan dapat diterapkan untuk menentukan tidak hanya tiamin bebas, tetapi juga kandungan tiamin total. Dalam hal ini, bentuk terikat tiamin pertama-tama dipecah dengan sediaan enzim yang mengandung fosfatase.
Metode fluorometri untuk menentukan vitamin B1. Sampel produk uji dalam jumlah 5-10 g, ditempatkan dalam mortar, digiling seluruhnya dengan 10-25 ml 0,1 N. larutan asam sulfat dan dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu dengan menggunakan larutan asam yang sama; Volume total cairan dalam labu disesuaikan hingga kira-kira 75 ml. Labu ditutup dengan kondensor refluks (udara) dan direndam dalam air mendidih. mandi air dan selama 45 menit, sambil mengaduk isinya secara berkala, tiamin diekstraksi. Dalam hal penentuan tiamin bebas, ekstrak yang dihasilkan didinginkan, larutan natrium asetat 2,5 molar ditambahkan hingga pH 5,0, volumenya disesuaikan hingga 100 ml dengan air suling, dicampur, disaring, dan 10-20 ml larutan. diambil untuk analisa lebih lanjut.
Saat menentukan kandungan tiamin total, ekstrak didinginkan hingga 35-40 ° C dan ditambahkan preparat enzim ke dalamnya, yang dalam jumlah 0,03 g per 1 g bahan kering sampel digiling terlebih dahulu dalam mortar dengan 2-3 ml larutan natrium asetat 2,5 molar, kemudian suspensi obat yang dihasilkan dipindahkan ke dalam labu menggunakan 2-3 ml larutan natrium asetat dan dengan larutan yang sama pH ekstrak diatur menjadi 5,0.
Setelah ditambahkan sediaan enzim, labu yang berisi ekstrak ditutup dengan kapas dan dimasukkan ke dalam termostat selama 12-15 jam pada suhu 37°C. Kemudian isi labu didinginkan, volumenya diatur hingga 100 ml dengan air suling, dicampur dan disaring. Penentuan lebih lanjut tiamin bebas dan kandungan totalnya dilakukan dengan cara yang sama.
10-20 ml filtrat dilewatkan melalui kolom adsorpsi untuk menyerap tiamin. Untuk tujuan ini, digunakan tabung kaca (Gbr. 25), yang memiliki dimensi sebagai berikut: di bagian atas - diameter 25 mm dan panjang 90 mm, di bagian tengah - diameter 7 mm dan panjang 150 mm, dan di bagian bawah - diameter 5 mm (diameter dalam 0,03-1,0 mm) dan panjang 30 mm. Glass wool ditempatkan di bagian tengah tabung dan adsorben dituangkan di atasnya; untuk penukar kation ODV-3 tinggi kolom harus sekitar 8 cm, kolom yang disiapkan untuk digunakan dipasang pada sumbat dalam gelas ukur berkapasitas 100 ml. Adsorben dicuci dengan 10 ml larutan asam asetat 3% dan larutan uji dilewatkan melalui kolom. Kemudian adsorben dicuci 3 kali dengan 10 ml air suling dan tiamin dielusi dari adsorben dengan larutan kalium klorida 25% dalam 0,1 N dipanaskan sampai mendidih. larutan asam klorida dalam porsi 6-7 ml. Eluat ditampung dalam gelas ukur bersih hingga volume 30 ml.
5 ml larutan yang dihasilkan dipipet ke dalam dua corong pemisah kecil; 3 ml campuran untuk oksidasi tiamin (larutan 0,4% kalium ferisianida dalam larutan natrium hidroksida 15%) ditambahkan ke corong pertama, dicampur dan 12 ml alkohol isobutil (butil atau isoamil) ditambahkan untuk mengekstrak tiokrom yang terbentuk. Tambahkan 3 ml larutan natrium hidroksida 15% ke dalam corong kedua (sampel kontrol), campur dan tambahkan 12 ml isobutil alkohol. Kedua corong dikocok selama 2 menit, campuran dibiarkan sampai benar-benar terpisah, lapisan bawah air-basa dipisahkan, dan lapisan alkohol disaring melalui kertas saring, di mana 2-3 g natrium sulfat anhidrat ditempatkan terlebih dahulu. ; Filtrat bening dikumpulkan dalam tabung reaksi kering, kemudian dipindahkan ke kuvet fluorometer. Larutan alkohol juga dapat didehidrasi dengan natrium sulfat langsung dalam corong pemisah; setelah menambahkan sekitar 2 g reagen, campuran dikocok dan larutan dehidrasi disaring melalui kertas saring ke dalam tabung reaksi kering.
Larutan tiokrom dari larutan standar tiamin dibuat sebagai berikut: tambahkan 1 ml larutan yang mengandung 1 μg tiamin ke dalam dua corong pisah dengan pipet ukur, tambahkan 4 ml larutan kalium klorida 25% lalu tambahkan 3 ml campuran untuk oksidasi ke dalam satu corong dan di corong kedua (sampel kontrol) - 3 ml larutan natrium hidroksida 15%. Isi corong dicampur dan ditambahkan 12 ml isobutil alkohol ke setiap corong. Kemudian lanjutkan seperti dijelaskan di atas.
Intensitas fluoresensi larutan alkohol yang disiapkan ditentukan pada fluorometer (Gbr. 26) dengan filter cahaya khusus menggunakan galvanometer sensitif. Intensitas fluoresensi diukur dalam empat larutan: dalam dua larutan uji (kontrol teroksidasi dan tidak teroksidasi) dan dalam dua larutan standar (kontrol teroksidasi dan tidak teroksidasi). Sekitar 8 ml larutan isobutil ditambahkan ke setiap kuvet.
dimana A adalah pembacaan fluorometer untuk larutan teroksidasi yang diuji; B - pembacaan fluorometer untuk larutan tidak teroksidasi yang diuji; A1 - pembacaan fluorometer untuk larutan standar teroksidasi; B1 - pembacaan fluorometer untuk larutan standar tidak teroksidasi; g - bagian yang ditimbang dari produk yang diteliti, g; V1 - total volume ekstrak, ml; V2 adalah volume ekstrak yang diambil untuk adsorpsi, ml; V3 - total volume eluat, ml; V4 - volume eluat yang diambil untuk oksidasi, ml; 1000 - faktor konversi, mg.
Persiapan reagen dasar dan sediaan
1. Larutan tiamin standar. 10 mg kristal tiamin klorida dilarutkan dalam 0,001 N. 25% larutan alkohol asam klorida dalam labu takar 100 ml. Solusinya tidak berubah selama 1-1,5 bulan bila disimpan dalam botol gelap di tempat sejuk. Untuk menyiapkan larutan kerja, tambahkan 1 ml larutan standar ke dalam labu 100 ml dan encerkan dengan air suling sampai tanda batas; larutan disiapkan sebelum analisis, mengandung 1 mcg tiamin dalam 1 ml.
2. 2,5 molar larutan natrium asetat. 340 g natrium asetat dilarutkan dalam air suling dan volumenya disesuaikan menjadi 1 liter.
3. larutan kalium klorida 25%. 250 g kalium klorida dilarutkan dalam air suling, ditambahkan 8,5 ml asam klorida pekat dan volumenya disesuaikan menjadi 1 liter dengan air.
4. Campuran untuk oksidasi - larutan kalium ferricyanide 0,04% dalam larutan natrium hidroksida 15%. Campuran dibuat sebelum analisis dengan mencampurkan 4 ml larutan kalium ferisianida 1% yang baru disiapkan dengan 96 ml larutan natrium hidroksida 15%.
5. Sediaan enzim dari Penicillium notatum atau Aspergillus oryza.
6. Penukar kation adsorben SDV-3. Penukar kation dihancurkan hingga ukuran partikel 0,5 hingga 0,13 mm dalam jumlah 70% dan kurang dari 0,13 mm - 30%. Untuk menghilangkan pengotor besi, proses tiga kali dengan asam klorida 10% selama 2 jam setiap kali pada suhu 40-60°C, cuci dengan air suling sampai reaksi terhadap klorin hilang dan aktifkan dengan mengeringkan pada suhu tidak melebihi 60-70°C .
Penentuan vitamin B2
Vitamin B2 (riboflavin) C17H20N4O6 ditemukan dalam makanan alami baik dalam keadaan bebas maupun terikat. Ada tiga bentuk riboflavin terikat yang diketahui: flavin mononukleotida, flavin adenin dinukleotida, dan bentuk ketiga yang terikat erat pada protein.
Metode penentuan vitamin B2 didasarkan pada khasiatnya larutan berair riboflavin memberikan fluoresensi kuning-hijau yang intens di bawah sinar ultraviolet. Saat menentukan kandungan total vitamin B2 menggunakan metode fluorometri, riboflavin formulir terkait dipindahkan ke keadaan bebas melalui hidrolisis enzimatik dan asam. Selama analisis, ekstrak dari produk alami diolah secara berurutan dengan permanganat dan natrium hidrosulfit untuk mengurangi jumlah pengotor fluoresen. Kemudian, dalam sampel terpisah, intensitas fluoresensi nonspesifik ditentukan, yang hanya bergantung pada pengotor yang tersisa; dalam sampel ini, riboflavin pertama-tama direduksi menjadi bentuk leuco yang tidak berwarna dan dengan demikian “memadamkan” fluoresensinya. Saat menghitung kandungan vitamin B2 pada produk yang diteliti, data fluoresensi nonspesifik dimasukkan sebagai koreksi terhadap hasil penentuan fluoresensi umum.
Penentuan kandungan total vitamin B2. Sampel produk (5-10 g) digiling seluruhnya dalam mortar dengan sedikit buffer fosfat (pH 7,8-8,0), dan kemudian dipindahkan ke labu menggunakan larutan buffer yang sama, sehingga pengenceran total menjadi perbandingan. 1:15 atau 1 :20. Labu yang berisi isinya dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 45 menit sambil sering diaduk, didinginkan hingga 30°C, nilai pH diperiksa dan jika terjadi pergeseran ke zona asam, pH diatur kembali menjadi 7,8- 8.0 dengan menambahkan buffer fosfat. Sediaan enzim (tripsin, pankreatin atau sediaan dari penicillium notatum) ditambahkan ke dalam ekstrak dalam jumlah 30 mg per 1 g bahan kering sampel, yang ditumbuk sebelumnya dalam mortar dengan 2-3 ml fosfat. buffer atau natrium asetat. Kap mesin disimpan dalam termostat pada suhu 37° C selama 12-20 jam; Selama hidrolisis enzimatik, bentuk riboflavin yang terikat erat dengan protein dipecah. Setelah pendinginan, ekstrak dibawa ke volume yang sesuai dengan pengenceran total 1:25 atau 1:30 dengan air suling dan disaring melalui filter berlipit.
Tambahkan 5 ml filtrat ke dalam labu kecil, tambahkan 5 ml asam trikloroasetat 20% dan panaskan dalam penangas air mendidih selama 10 menit. Larutan didinginkan dan 1/4 volume larutan 4 molar dikalium fosfat ditambahkan untuk mengatur pH menjadi 6,0. Kemudian larutan permanganat 4% ditambahkan tetes demi tetes ke dalam ekstrak untuk mengoksidasi pengotor fluoresen; larutan permanganat biasanya ditambahkan sebanyak 0,2-0,4 ml sampai muncul warna kemerahan pada ekstrak.
Ekstrak yang diberi permanganat didiamkan selama 10 menit, kemudian ditambahkan larutan hidrogen peroksida 3% tetes demi tetes sampai warnanya hilang; Saat menambahkan hidrogen peroksida, ekstrak terus dikocok. 0,2 ml larutan kerja stannous klorida dan 0,1 ml larutan natrium hidrosulfit 2,5% ditambahkan ke ekstrak untuk mengembalikan pengotor fluoresen. Ekstrak dikocok kuat-kuat selama 20 menit untuk mengubah riboflavin yang tereduksi secara reversibel menjadi bentuk fluoresen teroksidasi. Volume ekstrak disesuaikan menjadi 15 ml dengan air, bila terdapat kekeruhan larutan disaring. Dalam ekstrak yang disiapkan, intensitas fluoresensi ditentukan dibandingkan dengan intensitas fluoresensi larutan kerja standar riboflavin. Untuk melakukan ini, ekstrak dan larutan kerja riboflavin (lihat di bawah “persiapan reagen”) dituangkan ke dalam kuvet fluorometer 8-10 ml dan intensitas fluoresensi diukur pada skala galvanometer. Selanjutnya, tambahkan 0,1 g natrium hidrogen karbonat dan 0,1 g hidrosulfit ke kedua kuvet, campur isi kuvet dan ukur kembali intensitas fluoresensi. Dalam larutan standar riboflavin, fluoresensi padam hingga nol, dan dalam ekstrak yang diteliti, sedikit fluoresensi tetap ada, yang disebabkan oleh adanya pengotor fluoresen yang tidak sepenuhnya hilang ketika ekstrak diolah dengan reagen di atas. Untuk memastikan pemadaman fluoresensi riboflavin sepenuhnya, 0,1 g hidrosulfit ditambahkan ke sampel dan intensitas fluoresensi diukur lagi. Ketika teredam sepenuhnya, pembacaan galvanometer tidak akan berubah. Kandungan riboflavin dalam mikrogram per 1 g zat (x) dihitung menggunakan rumus
dimana A adalah pembacaan fluorometer untuk larutan uji (pembacaan pertama); B - pembacaan fluorometer untuk larutan uji setelah pendinginan (pembacaan kedua); C - pembacaan fluorometer untuk larutan standar yang mengandung 0,4 μg riboflavin dalam 1 ml; 0,4 - konsentrasi larutan standar, μg; g—berat produk, g; V - volume pengenceran total, ml.
Persiapan reagen dasar
1. Larutan riboflavin standar. Sampel riboflavin 10 mg dilarutkan dalam air suling dalam labu takar 250 ml. 1 ml larutan ini mengandung 40 mcg riboflavin. Larutannya tidak berubah selama 1 bulan bila disimpan dalam kondisi dingin dan gelap. Sebelum penentuan, siapkan larutan kerja, dimana 37,5 ml larutan asam trikloroasetat 20%, 25 ml larutan dikalium fosfat 4 molar, 1 ml larutan standar riboflavin ditambahkan ke dalam labu takar 100 ml. dan dibawa ke sasaran dengan air. 1 ml larutan kerja mengandung 0,4 μg riboflavin.
2. Campuran buffer fosfat (pH 7,8-8,0). Siapkan larutan 1/15 molar natrium fosfat dibasa (11,876 g Na2HPO4-2H2O yang direkristalisasi dalam 1 liter air) dan larutan 1/15 molar kalium fosfat tersubstitusi tunggal (9,078 g KH2PO4 rekristalisasi dalam 1 liter air). Campurkan 9,5 bagian larutan pertama dan 0,5 bagian larutan kedua.
3. Larutan stannous klorida. 10 g timah klorida (SnCl2) dilarutkan dalam 25 ml asam klorida pekat. Larutan stok yang dihasilkan disimpan dalam botol gelap dengan penutup tanah pada suhu kamar. Sebelum setiap penentuan, siapkan larutan kerja dengan mengencerkan 0,2 ml larutan stok dengan air hingga 100 ml.
4. Larutan natrium hidrosulfit. 0,25 g Na2S2O4-2H2O dilarutkan dalam 10 ml larutan natrium bikarbonat 2%. Solusinya disiapkan sebelum digunakan.
5. Sediaan enzim : trypsin, pankreatin atau sediaan enzim dari penicillium notatum.
Penentuan asam nikotinat (vitamin PP)
Dalam produk alami, vitamin PP (asam nikotinat) ditemukan dalam bentuk bebas dan terikat: sebagai asam nikotinat C6H5O2N atau Amida C6H6ON2. Untuk penentuan asam nikotinat, yang didasarkan pada interaksi asam nikotinat dengan tiosianat bromida atau sianida. Senyawa yang dihasilkan dengan adanya amina aromatik (anilin, metol) dalam lingkungan netral atau sedikit asam menghasilkan turunan berwarna kuning. Intensitas warna larutan uji berbanding lurus dengan jumlah asam nikotinat dan diukur secara kolorimetri.
Metode penentuan. Sampel produk uji yang dihancurkan diambil sebanyak 5 g, dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan ditambahkan 75 ml 2-N. larutan asam sulfat, cuci corong dan leher labu dengan larutan asam ini. Isi labu diaduk kuat-kuat. Labu ditempatkan dalam penangas air mendidih dan isinya dipanaskan selama 90 menit sambil sesekali diaduk. Setelah itu labu didinginkan, campuran ditepatkan dengan air suling sampai tanda batas, diaduk rata dan disaring melalui kertas saring. (Hidrolisat yang dihasilkan dapat dibiarkan dingin hingga keesokan harinya).
Ambil 25 ml filtrat, masukkan ke dalam labu ukur 50 ml, tambahkan satu tetes fenolftalein dan tambahkan 10 N. larutan natrium hidroksida sampai diperoleh warna merah muda samar (kurang lebih 4 ml). Kelebihan alkali dihilangkan dengan 1-2 tetes 5 N. asam sulfat (sampai warna merah jambu hilang). Jika larutan dipanaskan, dinginkan, lalu tambahkan 2 ml larutan seng sulfat dan 1-2 tetes isoamil alkohol (untuk menghilangkan busa). Kemudian sambil mengaduk isi labu, tambahkan tetes demi tetes larutan 4 N. soda kaustik sampai terbentuk endapan seng hidroksida yang kental. Pengendapan diselesaikan dengan menambahkan larutan 1 N. soda kaustik sampai muncul warna merah muda pucat. Tambahkan 1-2 tetes 5 N ke dalam labu. asam sulfat (sampai warna merah jambu hilang) dan diamkan selama 10 menit sambil sesekali diaduk. Campuran dalam labu dibawa ke 50 ml dengan air suling, diaduk dan disaring melalui kertas saring. Filtrat yang dihasilkan digunakan untuk melakukan reaksi warna, untuk tujuan ini digunakan tabung reaksi khusus dengan ground stopper, yang dimasukkan ke dalam wadah bundar. Pada saat yang sama, ketika melakukan reaksi warna pada larutan uji, operasi serupa diulangi dengan larutan standar asam nikotinat. Pada saat yang sama, kontrol ditempatkan pada reagen untuk larutan standar dan pada amina untuk subjek uji.
Daftar solusi yang digunakan dalam analisis diberikan dalam tabel. 5.
Untuk melakukan reaksi warna, 5 ml larutan standar asam nikotinat dituangkan ke dalam dua tabung reaksi (penentuan paralel), dan 5 ml air suling dituangkan ke dalam dua tabung reaksi, kemudian 5 ml larutan uji dituangkan ke dalam empat tabung reaksi. tabung reaksi lainnya. Semua tabung reaksi yang ditempatkan pada rak direndam dalam penangas bersuhu 50°C selama 5 menit, setelah itu ditambahkan 2 ml larutan rhodane bromida di bawah draft buret sesuai tabel. 5 (tidak termasuk kontrol untuk amina). Cairan dalam tabung reaksi dicampur dan dibiarkan dalam penangas selama 10 menit pada suhu 50°C. Tabung reaksi didinginkan dalam air dingin sampai suhu ruangan, masukkan ke dalam kotak kayu yang dilengkapi sarang tabung reaksi, tutup kotak dengan penutup dan diamkan di tempat gelap selama 10 menit. Tambahkan 3 ml larutan metol ke dalam tabung reaksi, campur isinya dan biarkan dalam kotak tertutup selama 1 jam di tempat gelap.
Setelah satu jam, larutan yang dihasilkan dikolorimeterisasi menggunakan fotoelektrokolorimeter menggunakan filter biru dalam kuvet dengan ketebalan lapisan 10 mm. Kandungan asam nikotinat dihitung sebagai berikut. Tetapkan kerapatan optik dari larutan uji (n) dan standar (n1), dengan mempertimbangkan koreksi untuk kontrol
di mana A adalah kerapatan optik larutan uji; A1 - sama, standar; B adalah kerapatan optik larutan kontrol untuk amina; B1 - kepadatan optik dari larutan kontrol untuk reagen.
Selanjutnya untuk menghitung kandungan asam nikotinat dalam mg% (x), gunakan rumus berikut:
dimana G adalah kandungan asam nikotinat dalam 1 ml larutan standar, mg; n adalah kerapatan optik larutan uji dengan mempertimbangkan larutan kontrol; n1 adalah kerapatan optik larutan standar dengan mempertimbangkan larutan kontrol; g - berat, g; V adalah volume total hidrolisat, ml; V1 - volume hidrolisat yang diambil untuk pemurnian dengan seng sulfat, ml; V2 adalah volume akhir larutan setelah penambahan seng sulfat, ml.
Persiapan reagen
1. Larutan standar asam nikotinat (basa). 500 mg asam nikotinat dimasukkan ke dalam labu 500 ml, ditambahkan 5 ml 10 N. H2SO4 dan, ketika kristal larut, tambahkan air suling sampai tanda tera. 1 ml larutan ini mengandung 1000 mcg asam nikotinat. Solusinya cocok untuk 1 tahun bila disimpan dalam kondisi dingin.
2. Solusi standar - berfungsi. 5 ml larutan standar basa diencerkan hingga 1 liter dengan air suling. 1 ml larutan ini mengandung 5 mcg asam nikotinat (larutan disiapkan setiap hari).
3. Larutan Rhodane bromida (disiapkan sebelum digunakan). Siapkan air brom dengan menambahkan brom ke dalam air suling sampai tetes brom berhenti larut. Untuk air brom yang didinginkan dengan es, diambil dalam jumlah yang diperlukan untuk analisis, tambahkan tetes demi tetes larutan 10% kalium atau amonium tiosianat sampai berubah warna menjadi kuning muda, dan kemudian larutan 1% dari reagen yang sama sampai air brom benar-benar berubah warna. Tambahkan secara bertahap, dalam porsi kecil, 20-50 mg kalsium karbonat sampai keluarnya gelembung dan pembentukan kekeruhan berhenti. Solusinya disaring ke dalam botol kaca gelap dengan ground stopper dan disimpan di tempat dingin.
4. Larutan metol 8% (siapkan sebelum digunakan). 8 g metol rekristalisasi dilarutkan dalam 0,5 N. Larutan HCl dan dipindahkan ke dalam gelas ukur atau labu ukur 100 ml, larutan diatur sampai tanda 0,5 N. HCl.
Rekristalisasi metol. 500 ml 0,1 n. H2SO4 dipanaskan sampai mendidih, 100 g metol, yang telah dicampur sebelumnya dengan 0,7 g NaHSO3, ditambahkan ke dalam larutan mendidih; campuran dipanaskan sampai mendidih. Jika larutan berwarna kuat, tambahkan 10 g karbon aktif. Campuran segera dipindahkan ke corong Buchner yang sudah dipanaskan sebelumnya dan disaring. Filtrat dipindahkan ke gelas kimia, ditambahkan 0,3 g natrium bisulfit dan 700 ml alkohol 96%; campur semuanya, rendam dalam air es dan biarkan di tempat gelap selama beberapa jam. Kristal metol yang diendapkan disaring melalui corong Buchner, dicuci pada corong dengan alkohol 96% dari botol semprot dan dikeringkan di udara dalam gelap. Metol yang dikristalisasi disimpan dalam botol kaca gelap dengan penutup ground-in di tempat gelap.
1. Vitamin B 1 (tiamin)
a) dengan pereaksi diazo
Prinsip metode ini. Pertama, diazobenzenesulfate (asam diazobenzenesulfonic) terbentuk:
Larutan tiamin dengan penambahan diazobenzena sulfat dan alkali menghasilkan senyawa berwarna.
Kemajuan. Berikut ini ditambahkan secara berurutan ke dalam tabung reaksi:
b) oksidasi menjadi tiokrom
Prinsip metode ini. Ketika terkena K 3 Fe(CN) 6 dalam media basa, tiamin dioksidasi menjadi tiokrom kuning, yang memiliki fluoresensi biru dalam sinar UV.
Kemajuan. 10 mg bubuk tiamin bromida atau tiamin klorida dilarutkan dalam 5 ml air, 1 ml larutan 5% kalium besi sulfida K 3 Fe(CN) 6 (kalium ferricyanide) dan 1 ml larutan natrium hidroksida 10% ditambahkan dan dicampur. Setengah dari volume yang dihasilkan dipanaskan dan warna kuning diamati sebagai hasil konversi tiamin menjadi tiokrom. Tambahkan 3 ml butil atau isoamil alkohol ke separuh lainnya, kocok rata dan biarkan selama beberapa menit. Lapisan atas alkohol diambil dengan dispenser ke dalam wadah yang terbuat dari kaca non-fluoresen dan diperiksa dalam sinar UV (atau dalam sinar lampu merkuri-kuarsa di ruangan gelap). Fluoresensi biru terlihat jelas.
c) ambil spektrum serapan (modul “spektral”, berkisar antara 350 hingga 220 nm) dan amati maksimumnya pada λ = 250-260 nm. Simpan grafik, transfer ke Paint, lalu tempelkan ke file “Grafik” (dokumen Word), tanda tangani, dan tempelkan ke dalam laporan. PERHATIAN! Ambil spektrum semua vitamin serentak untuk menghidupkan dan menghangatkan spektrofotometer hanya sekali. 
Spektrum UV tiamin hidroklorida (8 μg/ml) dalam larutan HCl 0,9%. Maksimum pada 246 nm.
2. Vitamin B2 (riboflavin)
a) dengan logam seng
Prinsip metode ini. Riboflavin direduksi oleh hidrogen yang dibebaskan menjadi leucoflavin yang tidak berwarna. Terjadi perubahan warna dari kuning menjadi kehijauan, kemudian menjadi merah tua, merah muda, dan kemudian warnanya hilang.
Kemajuan. 1 ml suspensi riboflavin dalam air (larutan 0,015 - 0,025%) dituangkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 tetes HCl pekat dan ditetesi sepotong logam seng. Pelepasan gelembung hidrogen secara cepat dimulai, dan cairan berangsur-angsur berubah menjadi merah muda atau merah, kemudian warna cairan mulai memudar dan berubah warna (oksidasi terbalik leukoflavin menjadi riboflavin).
b) dengan perak nitrat
Prinsip metode ini. Larutan riboflavin yang netral atau sedikit asam (pH 6,5-7,2), bereaksi dengan AgNO 3, menghasilkan senyawa berwarna merah jambu-merah. Intensitas warnanya tergantung pada konsentrasi vitamin.
Kemajuan. Ke dalam 1 ml larutan riboflavin (0,015 - 0,025%) tambahkan 0,5 ml larutan AgNO 3 (0,1%). Muncul warna merah jambu.
c) fluoresensi dalam UV + pemadamannya setelah penambahan SnCl 2 + Na 2 S 2 O 4, yang memadamkan fluoresensi vitamin itu sendiri, tetapi bukan pengotor. Fluoresensi riboflavin maksimum pada pH 3,5-7,5. Catat spektrumnya dalam larutan natrium asetat.
Spektrum UV riboflavin (35 μg/ml) dalam larutan natrium asetat CH 3 COONa
0,01%. Maksimum pada 266,5 nm. Puncak tambahan pada 223,0 nm, 373,5 nm, dan 444,5 nm.
3. Vitamin B 5 (PP, asam nikotinat)
a) dengan tembaga asetat
Prinsip metode ini. Ketika asam nikotinat dipanaskan dengan tembaga asetat, terbentuk endapan garam tembaga dari asam nikotinat.
Kemajuan. 5-10 mg asam nikotinat dilarutkan ketika dipanaskan dalam 10-20 tetes larutan asam asetat 10% (atau siapkan 0,75% larutan nikotin asam di air panas, lalu tambahkan 1 ml larutan asam asetat 15% ke dalam 2 ml larutan ini). KE dipanaskan hingga mendidih tambahkan larutan tembaga asetat 5% dengan volume yang sama ke dalam larutan. Cairan menjadi keruh kebiruan, dan setelah didiamkan dan didinginkan, endapan biru tembaga nikotinat mengendap.
b) bau piridin
Prinsip metode ini. Ketika asam nikotinat dipanaskan dengan Na 2 CO 3 anhidrat, hal itu akan terasa bau busuk piridin.
Kemajuan. Dalam wadah porselen kecil yang kering, campurkan 0,05 g asam nikotinat dengan 0,1-0,15 g natrium karbonat anhidrat dan panaskan. Bau piridin yang menyengat muncul.
4. Vitamin B6 (piridoksin)
a) dengan besi klorida
Prinsip metode ini. Vitamin B 6 membentuk kompleks berwarna merah darah dengan besi klorida.
Kemajuan. 4 ml larutan piridoksin 0,5-1% + 0,5 ml FeCl 3 1% → kocok dan amati warna merahnya.
b) TAMBAHAN –
c) ambil spektrum dalam NaOH 0,1 M (amati maksimum pada λ = 245 dan 308 nm) atau air (lihat gambar).
Spektrum UV piridoksin hidroklorida (15 µg/ml) dalam air (pH≈6.0). Maksimum pada 291 nm.
5. Vitamin B12 – meresmikannya dalam laporan, tetapi dalam praktiknya kami tidak melakukan ini karena tingginya toksisitas reagen aktif.
Vitamin B 12 bereaksi dengan sianida pada pH = 10 membentuk disianokobalamin ungu, karena Co dioksidasi menjadi valensi 3 dan 5'-deoksiadenosin digantikan oleh anion CN.
6. Vitamin P (menggunakan rutin sebagai contoh)
Zat dengan aksi vitamin P mencakup sejumlah senyawa yang bersifat fenolik, yang efek fisiologis utamanya adalah mengurangi permeabilitas dan meningkatkan kekuatan kapiler. Mereka mempromosikan penyerapan vitamin C dalam tubuh manusia dan hewan, berpartisipasi aktif dalam proses redoks, memiliki sifat antioksidan, menghambat, antara lain, oksidasi adrenalin. Mereka juga menonaktifkan enzim hyaluronidase, sehingga menghambat pemecahannya asam hialuronat– heteropolisakarida dalam substansi dasar jaringan ikat. vit. P menghambat aktivitas kolinesterase, suksinat dehidrogenase dan sejumlah enzim lainnya.
Sejumlah flavonol (rutin, quercetin), flavanon, katekin, kumarin, asam galat dan turunannya, antosianin (pewarna dari buah-buahan, beri, bunga) memiliki khasiat vitamin.
Banyak zat vitamin P merupakan glikosida dari flavonol dan flavanon atau aglikon (komponen glikosida non-karbohidrat). Misalnya, rutin adalah glikosida yang mengandung disakarida rutinosis aglikon dengan struktur fenolik, flavonol, ditambahkan kuersetin.
a) dengan besi klorida
b) dengan asam sulfat
Prinsip: Asam sulfat pekat membentuk garam oksonium dengan flavon (rutin), yang ada dalam larutan warna kuning. Flavanon (misalnya hesperidin) memberi warna merah tua dengan belerang.
7. Vitamin C
a) secara kualitatif - dengan K 3 Fe(CN) 6
Prinsip metode ini: reduksi kalium ferricyanide dengan vitamin C dengan perubahan warna menjadi biru akibat terbentuknya warna biru Prusia.
Kemajuan. Dalam dua tabung reaksi, campurkan 5 tetes larutan 5% K 3 Fe(CN) 6 dengan 5 tetes larutan FeCl 3 1%. Tambahkan 20 tetes larutan asam askorbat 1% atau jus kubis ke dalam salah satu tabung reaksi ke dalam cairan berwarna coklat kehijauan, dan jumlah air sulingan yang sama ke tabung lainnya. Cairan dalam tabung reaksi pertama memperoleh warna biru kehijauan, dan endapan biru dari endapan biru Prusia; pada tabung reaksi kedua (kontrol), warna cairan coklat kehijauan tetap tidak berubah.
Pengalaman 1.Penentuan kuantitatif vitamin C.
Prinsip metode ini. Metode ini didasarkan pada kemampuan vitamin C untuk mereduksi 2,6-diklorofenolindofenol, yang berwarna merah dalam lingkungan asam dan berubah warna saat direduksi; dalam lingkungan basa warnanya biru. Untuk melindungi vitamin C dari kerusakan, larutan uji dititrasi dalam media asam dengan larutan basa 2,6-diklorofenolindofenol sampai muncul warna merah muda.
Untuk menghitung kandungan asam askorbat pada produk seperti kubis, kentang, jarum pinus, rose hip, dll, gunakan rumus:
Di mana X– kandungan asam askorbat dalam miligram per 100 g produk; 0,088 – kandungan asam askorbat, mg; A– hasil titrasi dengan larutan 0,001 N 2,6-diklorofenolindofenol, ml; B - volume ekstrak yang diambil untuk titrasi, ml; DI DALAM - jumlah produk yang diambil untuk dianalisis, g; G– jumlah total ekstrak, ml; 100 – konversi per 100 g produk.
Kesimpulan: tuliskan hasil percobaan dan data yang dihitung.
Eksperimen 1.1. Penentuan kandungan vitamin C pada kubis.
Urutan pekerjaan.
Timbang 1 g kubis, haluskan dalam mortar dengan 2 ml larutan asam klorida 10% (HCl - Asam klorida, asam klorida, asam klorida), tambahkan 8 ml air dan saring. Ukur 2 ml filtrat untuk titrasi, tambahkan 10 tetes larutan asam klorida 10% dan titrasi dengan 2,6-diklorofenolindofenol sampai warna merah muda bertahan selama 30 detik, berdasarkan hal ini prinsip metode reaksi. Hitung kandungan asam askorbat dalam 100 g kubis menggunakan rumus di atas. 100 g kubis mengandung 25-60 mg asam askorbat, 100 g rose hips 500-1500 mg, dan jarum pinus 200-400 mg.
Eksperimen 1.2. Penentuan kandungan vitamin C pada kentang.
Urutan pekerjaan.
Timbang 5 g kentang, haluskan dalam lesung dengan 20 tetes larutan asam klorida 10% (agar kentang tidak menjadi gelap). Tambahkan air suling secara bertahap - 15 ml. Massa yang dihasilkan dituangkan ke dalam gelas, larutan dibilas dengan air, dituangkan ke dalam gelas di atas batang kaca dan dititrasi dengan 0,001 N. larutan 2,6-diklorofenolindofenol menjadi warna merah jambu, berdasarkan hal ini prinsip metode reaksi. 100 g kentang mengandung 1-5 mg vitamin C.
Kesimpulan: tuliskan hasil percobaannya.
Eksperimen 1.3. Penentuan kandungan vitamin C dalam urin.
Penentuan kandungan vitamin C dalam urin memberikan gambaran tentang cadangan vitamin ini dalam tubuh, karena ada kesesuaian antara konsentrasi vitamin C dalam darah dan jumlah vitamin yang dikeluarkan melalui urin. Namun dengan hipovitaminosis C, kandungan asam askorbat dalam urin tidak selalu berkurang. Seringkali hal ini normal, meskipun terdapat kekurangan vitamin ini dalam jumlah besar di jaringan dan organ.
Pada orang sehat, pemberian oral 100 mg vitamin C dengan cepat menyebabkan peningkatan konsentrasinya dalam darah dan urin. Dengan hipovitaminosis C, jaringan yang kekurangan vitamin C mempertahankan vitamin C yang dikonsumsi dan konsentrasinya dalam urin tidak meningkat. Urine orang sehat mengandung 20-30 mg vitamin C atau 113,55-170,33 µmol/hari. Pada anak-anak, kadar vitamin ini menurun dengan penyakit kudis, serta penyakit menular akut dan kronis.
Pendahuluan…………………………………………………………………………………2
1. Gambaran umum metode penentuan vitamin…………………3
2. Metode kromatografi untuk menentukan vitamin…………5
3. Metode elektrokimia untuk menentukan vitamin…………10
4. Penentuan metode stripping voltametri
vitamin B 1 B 2 yang larut dalam air dalam produk makanan………..13
Kesimpulan…………………………………………………...18
Perkenalan
Saat ini, sejumlah besar produk makanan yang diperkaya untuk pakan manusia dan hewan, yang merupakan campuran multikomponen kering, telah muncul di pasaran. Kisaran produk tersebut cukup luas. Ini adalah, pertama-tama, bahan tambahan makanan yang aktif secara biologis, premix, pakan untuk hewan dan burung, dan sediaan multivitamin. Kriteria kualitas produk tersebut mungkin adalah analisis kandungan vitamin dan, khususnya, vitamin penting seperti yang larut dalam air dan vitamin yang larut dalam lemak, yang jumlahnya diatur oleh dokumen peraturan dan standar kualitas sanitasi.
Digunakan untuk menentukan vitamin berbagai metode. Metode analisis optik yang banyak digunakan adalah reagen yang padat karya, memakan waktu dan mahal; penggunaan metode kromatografi diperumit dengan penggunaan peralatan yang mahal. Setiap tahun ragamnya bertambah dan produksi pangan meningkat, resep ditingkatkan makanan bayi. Hal ini, pada gilirannya, meningkatkan tuntutan terhadap pemantauan kualitas produk dan peningkatan metode penentuan vitamin. Persyaratan medis dan biologis dan standar sanitasi Kualitas bahan baku pangan dan produk pangan menjadi ciri nilai gizi sebagian besar jenis dan kelompok produk makanan bayi untuk berbagai keperluan.
1. Gambaran umum metode penentuan vitamin
Hampir semua vitamin mudah mengalami oksidasi, isomerisasi dan hancur di bawah pengaruh suhu tinggi, cahaya, oksigen atmosfer, kelembaban dan faktor lainnya.
Dari metode yang ada Untuk penentuan vitamin C (asam askorbat), metode yang paling banyak digunakan adalah titrasi visual dan potensiometri dengan larutan 2,6-di-klorofenolindofenol menurut GOST 24556-81, berdasarkan sifat pereduksi asam askorbat dan kemampuannya untuk kurangi 2,6-DCPIP. Warna biru tua pada indikator ini menjadi tidak berwarna bila ditambahkan asam askorbat. Penyiapan ekstrak produk yang diteliti merupakan hal yang penting. Ekstraktan terbaik adalah larutan asam metafosfat 6%, yang menonaktifkan oksidase asam askorbat dan mengendapkan protein.
Karoten dalam bahan baku nabati, konsentrat dan minuman ringan dikontrol dengan metode fisikokimia sesuai dengan GOST 8756.22-80. Metode ini didasarkan pada penentuan fotometrik fraksi massa karoten dalam larutan yang diperoleh selama ekstraksi dari produk dengan pelarut organik. Larutannya terlebih dahulu dimurnikan dari zat pewarna yang menyertainya dengan menggunakan kromatografi kolom. Karoten mudah larut dalam pelarut organik (eter, bensin, dll) dan memberi warna kuning. Untuk penentuan kuantitatif karoten, kromatografi adsorpsi digunakan pada kolom dengan aluminium oksida dan magnesium oksida. Penentuan pigmen pada suatu kolom bergantung pada aktivitas adsorben, jumlah pigmen, dan keberadaan komponen lain dalam campuran yang dipisahkan. Campuran kering aluminium oksida mempertahankan karoten, dan campuran basah memungkinkan zat pewarna lain masuk ke dalam larutan.
Tiamin terutama ditemukan dalam keadaan terikat dalam bentuk ester difosfor - kokarboksilase, yang merupakan gugus aktif dari sejumlah enzim. Dengan bantuan hidrolisis asam dan di bawah pengaruh enzim, tiamin dilepaskan dari keadaan terikatnya. Metode ini menentukan jumlah tiamin. Untuk menghitung kandungan vitamin B1 digunakan metode fluorometri yang digunakan untuk menentukan tiamin dalam produk makanan. Hal ini didasarkan pada kemampuan tiamin untuk terbentuk dalam lingkungan basa dengan ferricanide calanium thiochrome, yang memberikan fluoresensi intens pada butil alkohol. Intensitas proses dipantau menggunakan fluorometer EF-ZM.
Pada makanan dan minuman, riboflavin terdapat dalam keadaan terikat, yaitu dalam bentuk ester fosfor yang terikat pada protein. Untuk menentukan jumlah riboflavin dalam makanan, perlu dilepaskan dari keadaan terikatnya melalui hidrolisis asam dan perlakuan dengan sediaan enzim. Vitamin B1 dalam minuman ringan dihitung menggunakan metode kimia untuk menentukan jumlah bentuk riboflavin yang mudah terhidrolisis dan terikat erat dalam jaringan. Metode ini didasarkan pada kemampuan riboflavin untuk berfluoresensi sebelum dan sesudah direduksi dengan natrium hiposulfit. Penentuan kandungan total senyawa fenolik. Untuk melakukan ini, gunakan metode kolorimetri Folin-Denis, yang didasarkan pada pembentukan kompleks biru selama reduksi asam tungstat di bawah pengaruh polifenol dengan reagen dalam media basa. Senyawa fenolik ditentukan oleh asam klorogenat menggunakan fotometri nyala menggunakan alat EKF-2.
2. Metode kromatografi untuk menentukan vitamin
Belakangan ini, metode kromatografi cair kinerja tinggi berkembang pesat di luar negeri. Hal ini terutama disebabkan oleh munculnya kromatografi cair presisi dan peningkatan teknik analisis. Meluasnya penggunaan metode HPLC dalam penentuan vitamin juga tercermin dari banyaknya publikasi. Sampai saat ini, lebih dari separuh karya yang diterbitkan tentang analisis vitamin yang larut dalam air dan lemak dikhususkan untuk penggunaan metode ini.Berbagai varian kromatografi telah tersebar luas dalam penentuan vitamin.
Untuk memurnikan tokoferol dari pengotor asing digunakan metode kromatografi lapis tipis, dikombinasikan dengan metode spektrofotometri dan fluorimetri, metode ini juga digunakan untuk menentukan vitamin E secara kuantitatif. Saat memisahkan, digunakan pelat dengan silufol dan tanah diatom.
Analisis isomer tokoferol di minyak zaitun dilakukan dengan kromatografi gas-cair. Teknik analisis GC dan GLC memerlukan produksi turunan yang mudah menguap, yang sangat sulit ketika menganalisis vitamin yang larut dalam lemak. Oleh karena itu, metode penentuan ini tidak banyak digunakan. Penentuan vitamin E dalam produk makanan, obat-obatan dan objek biologi dilakukan dalam mode gradien dan isokratik baik dalam kondisi fase normal maupun fase terbalik. Silica gel (SG), kieselguhr, silasorb, ODS-Hypersil dan pembawa lainnya digunakan sebagai adsorben. Untuk pemantauan terus menerus komposisi eluat dalam kromatografi cair saat menganalisis vitamin dan meningkatkan sensitivitas penentuan, UV (A = 292 nm), spektrofotometri (X = 295 nm), fluoresen (X = 280/325 nm), elektrokimia, PMR dan spektroskopi massa digunakan sebagai detektor.
Kebanyakan peneliti lebih suka menggunakan kromatografi adsorpsi untuk memisahkan campuran kedelapan isomer tokoferol dan asetatnya. Dalam kasus ini, fase gerak biasanya berupa hidrokarbon yang mengandung sedikit eter. Metode yang tercantum untuk menentukan vitamin E, sebagai suatu peraturan, tidak menyediakan saponifikasi awal sampel, yang secara signifikan mengurangi waktu analisis.
Pemisahan dengan penentuan kuantitatif simultan kandungan vitamin yang larut dalam lemak (A, D, E, K) bila keduanya ada bersama dalam sediaan multivitamin dilakukan dalam fase maju dan mundur. Namun, sebagian besar peneliti lebih suka menggunakan HPLC versi fase terbalik. Metode HPLC memungkinkan Anda menganalisis vitamin B1 dan B2 yang larut dalam air baik secara bersamaan maupun terpisah. Untuk pemisahan vitamin, digunakan versi HPLC fase terbalik, pasangan ion, dan penukar ion. Mode kromatografi isokratik dan gradien digunakan. Pemisahan awal analit dari matriks dilakukan dengan hidrolisis enzimatik dan asam sampel.
Keuntungan metode kromatografi cair:
Deteksi simultan beberapa komponen
Menghilangkan pengaruh komponen-komponen yang mengganggu
Kompleks ini dapat dengan cepat dibangun kembali untuk melakukan analisis lainnya.
Komposisi dan karakteristik peralatan dan perangkat lunak kromatografi cair "Khromos ZH-301":
Tabel 1
|
Keunggulan kromatografi "Chromos ZH-301":
Stabilitas tinggi dan keakuratan menjaga laju aliran eluen dipastikan dengan desain pompa bertekanan tinggi.
Akses mudah ke kolom dipastikan dengan desain perangkat.
Efisiensi pemisahan dipastikan dengan penggunaan kolom kromatografi kinerja tinggi.
Rentang linier yang luas dari sinyal pengukuran detektor tanpa mengalihkan batas pengukuran, yang memungkinkan Anda mengukur puncak konsentrasi tinggi dan rendah dengan akurasi tinggi.
Analisis kromatogram vitamin yang larut dalam air:
1 asam askorbat (C),
2 asam nikotinat (Niacin),
3 piridoksin (B6),
4 tiamin (B1),
5 nikotinamida (B3),
6 asam folat (M),
7 sianokobalamin (B12),
8 riboflavin (B2).
Analisis kromatogram vitamin yang larut dalam lemak:
1. Vitamin A
2. toko
3. y-tokoferol
4. a-tokoferol (Vitamin E)
5. lutein
6. Zeaksantin
7. Kriptoxantin
8. a-karoten
Meskipun metode HPLC memiliki sensitivitas yang tinggi, tingginya biaya instrumen, serta durasi analisis, dengan mempertimbangkan waktu persiapan sampel, secara signifikan membatasi penggunaannya di laboratorium analitik di negara kita.
KEMENTERIAN KESEHATAN FEDERASI RUSIA
PASAL FARMAKOPOE UMUM
Metode kuantitatifOFS.1.2.3.0017.15
penentuan vitamin Daripada Art. pacarXI, edisi 2
Artikel ini menguraikan prinsip-prinsip umum penentuan vitamin dalam zat dan bentuk sediaan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), spektrofotometri dan titrimetri.
Metode standar yang diberikan memungkinkan penentuan kuantitatif senyawa berikut: vitamin A (retinol, retinol asetat dan retinol palmitat), vitamin D (kolekalsiferol dan ergokalsiferol), vitamin E (a-tokoferol dan a — tokoferol asetat), vitamin K 1 (phytomenadione), b-karoten, vitamin B 1 (tiamin klorida, tiamin bromida dan tiamin mononitrat), B 2 (riboflavin, riboflavin mononukleotida), B 3 (asam nikotinat, nikotinamida), B 5 ( asam pantotenat dan garamnya, panthenol), B 6 (piridoksin hidroklorida), B C (asam folat), B 12 (sianokobalamin), vitamin C (asam askorbat atau garam natrium atau kalsiumnya, ascorbyl palmitate), D— biotin, rutin.