Laboratorium penyakit metabolik herediter diciptakan di Medico-genetik pusat ilmiah lebih dari 30 tahun yang lalu. Pekerjaan pertama di laboratorium terkait dengan pengembangan tes untuk mendeteksi fenilketonuria dan program skrining selektif. penyakit keturunan metabolisme (NBO). Secara bertahap, laboratorium beralih ke penggunaan metode biokimia dan genetika molekuler yang kompleks untuk diagnosis penyakit keturunan yang akurat. Di sinilah, di bawah bimbingan Profesor Xenia Dmitrievna Krasnopolskaya, pendekatan diagnosis biokimia penyakit organel sel dikembangkan. Hari ini adalah satu-satunya laboratorium di Rusia di mana diagnosa postnatal dan prenatal dari sebagian besar penyakit dari kelompok ini dilakukan.

Satu dari arah ilmiah Pekerjaan divisi ini adalah mencari penanda biokimia baru untuk penyakit keturunan dan mengembangkan metode baru untuk diagnosis yang efektif.

Rentang metode biokimia yang digunakan di laboratorium sangat luas dan meliputi: elektroforesis glikosaminoglikan urin, pemfokusan isoelektron transferrin, spektrometri massa kromato, kromatografi cair kinerja tinggi, analisis aktivitas enzim lisosom dan mitokondria menggunakan substrat kromogenik dan fluorogenik, dan oksigrafi. Beberapa bentuk NBO, yang sebelumnya tidak terdeteksi di negara kita, didiagnosis di laboratorium untuk pertama kalinya.

Terobosan signifikan dalam diagnosis NBO adalah pengenalan metode spektrometri massa tandem, yang memungkinkan untuk mendeteksi sekitar 30 bentuk penyakit keturunan dari kelompok NBO yang paling umum dalam jumlah mikro bahan biologis (titik darah kering atau plasma): aminoasidopati, asiduria organik, dan defek pada -oksidasi mitokondria.

Dalam beberapa tahun terakhir, metode genetika molekuler telah dikembangkan secara aktif di laboratorium. Untuk beberapa penyakit dari kelompok NBO, protokol diagnostik DNA telah dibuat untuk mengurangi waktu untuk menegakkan diagnosis dan menghindari penggunaan metode biokimia yang memakan waktu dan invasif. Sejak 2015, lab telah menggunakan pengurutan generasi berikutnya untuk menganalisis banyak gen secara bersamaan. Panel semacam itu telah dikembangkan untuk penyakit mitokondria, penyakit hati herediter, leukodistrofi/leukoensefalopati.

Sampai saat ini, metode genetik biokimia dan molekuler yang digunakan memungkinkan untuk mendiagnosis lebih dari 200 bentuk penyakit metabolik herediter yang berbeda.

Laboratorium sedang mengerjakan karakterisasi spektrum dan frekuensi mutasi pada mucopolysaccharidosis herediter, sphingolipidoses, lipofuscinosis seroid neuronal, algoritma sedang dikembangkan untuk mendiagnosis penyakit yang terjadi dengan kerusakan materi putih otak, serta gangguan neurometabolik herediter lainnya .

Keterangan

Pelatihan

Indikasi

Interpretasi hasil

Dokumen yang harus dilengkapi

Keterangan

Metode penentuan

Spektrometri massa tandem dengan ionisasi elektrospray.

Materi yang sedang dipelajari Darah kapiler dikumpulkan pada kartu filter khusus No. 903

Analisis spektrum asam amino dan asilkarnitin dengan spektrometri massa tandem (TMS)

Apa itu gangguan metabolisme? Gangguan metabolisme herediter atau dengan kata lain metabolisme adalah sekitar 500 penyakit berbeda yang disebabkan oleh tidak berfungsinya katalis biokimia khusus - enzim. Enzim menyediakan proses untuk pemecahan asam amino, asam organik, asam lemak dan biomolekul lainnya. Banyak yang keliru percaya bahwa karena penyakit dari kelompok ini sangat jarang, mereka harus disingkirkan terakhir. Namun, menurut literatur*, satu dari 3000 bayi baru lahir menderita gangguan metabolisme herediter!

Tempat khusus di antara penyakit ini ditempati oleh penyakit yang dimulai pada anak usia dini. Penyakit ini sering dikaitkan dengan patologi neonatus yang parah dan / atau terjadi dengan kedok kondisi seperti sepsis, lesi perinatal sistem saraf, infeksi intrauterin. Deteksi terlambat terhadap penyakit dari kelompok ini dapat menyebabkan kecacatan parah atau bahkan kematian. Telah ditetapkan bahwa 5%** dari semua kasus "sindrom" kematian mendadak bayi" - konsekuensi dari gangguan metabolisme herediter. Namun, beberapa penyakit ini dapat diobati secara efektif dengan diagnosis yang tepat waktu. Salah satu metode modern untuk mendiagnosis gangguan metabolisme adalah spektrometri massa tandem (TMS). Metode ini memungkinkan Anda untuk menentukan dalam sejumlah kecil bahan biologis (setetes darah kering), yang memungkinkan Anda untuk mencurigai penyakit keturunan dengan probabilitas tertentu. Di beberapa negara, metode ini digunakan untuk menyaring semua bayi baru lahir untuk 10-30 gangguan metabolisme herediter. Dengan kata lain, semua bayi baru lahir menjalani studi biokimia khusus yang disebut skrining. * Vilarinho L, Rocha H, Sousa C, Marcão A, Fonseca H, Bogas M, Osório RV. Empat tahun perluasan skrining bayi baru lahir di Portugal dengan spektrometri massa tandem. J Mewarisi Metab Dis. 2010 Feb 23 ** Olpin SE Investigasi metabolik kematian bayi mendadak. Ann Clin Biochem, 2004, Jul 41 (Pt4), 282-293 **Opdal SH, Rognum TO Gen Sindrom Kematian Bayi Mendadak: Apakah Itu Ada? Pediatri, 2004, V.114, N.4, hlm. e506-e512 Apakah penyaringan itu? Skrining (dari bahasa Inggris. Screening - sifting) adalah pemeriksaan massal pasien untuk mengidentifikasi berbagai penyakit, diagnosis dini yang membantu untuk mencegah perkembangan komplikasi parah dan kecacatan. Penyakit apa yang menjadi skrining wajib bayi baru lahir di negara kita? Di Rusia, ada program negara yang mencakup pemeriksaan wajib (penyaringan) semua bayi baru lahir hanya untuk 5 penyakit keturunan: fenilketonuria (PKU), fibrosis kistik, galaktosemia, sindrom adrenogenital, dan hipotiroidisme kongenital.

Kami menarik perhatian Anda pada fakta bahwa daftar ini hanya mencakup skrining fenilketonuria dari daftar ini (tumit) (lihat daftar lengkap penyakit metabolik herediter yang terdeteksi menggunakan skrining tumit di bawah).

Untuk penyakit apa anak bisa diperiksa tambahan? Skrining bayi baru lahir, yang ditujukan untuk mendiagnosis gangguan metabolisme oleh TMS, saat ini tidak dilakukan di Rusia. Di Rusia, penelitian ini masih dilakukan seperti yang ditentukan oleh dokter jika ada kecurigaan penyakit metabolisme herediter, meskipun banyak penyakit dari kelompok ini tidak muncul segera setelah lahir, tetapi bayi yang baru lahir sudah memilikinya. Namun, metode spektrometri massa tandem (TMS) yang disebutkan sebelumnya juga dapat memeriksa anak yang baru lahir untuk menyingkirkan 37 penyakit keturunan berbeda yang berhubungan dengan gangguan metabolisme asam amino, asam organik, dan cacat pada -oksidasi asam lemak. Aminoacidopathy Aminoacidopathy berkembang karena kurangnya enzim spesifik yang diperlukan untuk metabolisme asam amino. Hal ini menyebabkan abnormal level tinggi asam amino dan turunannya dalam darah dan urin, yang memiliki efek toksik pada sel dan jaringan tubuh. Gejala utama adalah keterlambatan perkembangan, kejang, koma, muntah, diare, bau urin yang tidak biasa, gangguan penglihatan dan pendengaran. Pengobatan terdiri dari peresepan diet khusus dan vitamin. Efektivitas terapi tergantung pada seberapa dini dan akurat diagnosis dibuat. Sayangnya, beberapa penyakit dari kelompok ini tidak dapat diobati. Asiduria/asidemia organik Asiduria/asidemia organik adalah hasil dari kerusakan pada pemecahan kimia asam amino karena aktivitas enzim yang tidak mencukupi. Mereka manifestasi klinis mirip dengan manifestasi aminoasidopati. Perawatan terdiri dari resep diet khusus dan/atau vitamin. Sayangnya, beberapa penyakit dari kelompok ini tidak dapat diobati. Cacat -oksidasi asam lemak -oksidasi asam lemak adalah proses pembelahan multitahap, sebagai akibatnya energi yang diperlukan untuk kehidupan sel terbentuk. Setiap langkah dari proses oksidasi dilakukan di bawah aksi enzim tertentu. Dengan tidak adanya salah satu enzim, proses terganggu. Gejala: mengantuk, koma, muntah, gula darah rendah, kerusakan hati, jantung, otot. Perawatan terdiri dari penunjukan diet rendah lemak dengan pemberian makan yang sering dan fraksional, spesialisasi lainnya produk makanan dan juga levocarnitine. Daftar lengkap penyakit metabolik herediter yang terdeteksi

1. Penyakit dengan bau urin sirup maple (leucinosis).
2. Citrulinemia tipe 1, citrulinemia neonatus.
3. Asiduria argininosuksinat (ASA) / defisiensi argininosuksinat liase.
4. Defisiensi ornithine transcarbamylase.
5. Defisiensi karbamil fosfat sintase.
6. Defisiensi N-asetilglutamat sintase.
7. hiperglikemia nonketotik.
8. Tirosinemia tipe 1.
9. Tirosinemia tipe 2.
10. Homocystinuria/defisiensi cystathionine beta synthetase.
11. Fenilketonuria.
12. Defisiensi argininemia/arginase.
13. Acidemia propionat (kekurangan propionil KoA karboksilase).
14. Acidemia metilmalonat.
15. Acidemia isovaleric (kekurangan isovaleryl CoA dehydrogenase).
16. Defisiensi 2-metilbutiril KoA dehidrogenase.
17. Defisiensi isobutyryl CoA dehydrogenase.
18. Acidemia glutaric tipe 1 (kekurangan glutaryl-CoA dehydrogenase tipe 1).
19. Defisiensi 3-metilkrotonil KoA karboksilase.
20. Defisiensi karboksilase multipel.
21. defisiensi biotinidase.
22. Acidemia malonat (kekurangan malonil CoA dekarboksilase).
23. Defisiensi asetoasetil KoA tiolase mitokondria.
24. Defisiensi 2-metil-3-hidroksibutiril CoA dehidrogenase.
25. Defisiensi 3-hidroksi-3-metilglutaril KoA liase.
26. Defisiensi 3-metilglutakonil KoA hidratase.
27. Defisiensi asil-CoA dehidrogenase rantai menengah.
28. Defisiensi asil-CoA dehidrogenase rantai sangat panjang.
29. Defisiensi rantai pendek asil-KoA dehidrogenase.
30. Defisiensi rantai panjang 3-hidroksiasil-KoA dehidrogenase (cacat protein trifungsional).
31. Acidemia glutaric tipe II (defisiensi glutaryl-CoA dehydrogenase tipe II), defisiensi asil-CoA dehydrogenases multipel.
32. Gangguan transportasi karnitin.
33. Defisiensi karnitin palmitoil transferase tipe I.
34. Defisiensi karnitin palmitoil transferase tipe II.
35. Defisiensi karnitin/asilkarnitin translokase.
36. Defisiensi 2,4-dienoyl CoA reduktase.
37. Defisiensi rantai menengah 3-ketoacyl-CoA thiolase.
38. Defisiensi asil-CoA dehidrogenase rantai sedang/pendek.

Bahan untuk penelitian: darah kapiler dikumpulkan pada kartu filter khusus No. 903.

literatur

1. Chace D.H., Kalas T.A., Naylor E.W. Penerapan spektrometri massa tandem untuk skrining neonatal untuk kelainan bawaan metabolisme perantara. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2002; jilid 3; P. 17-45.
2. Leonard J.V., Dezateux C. Skrining untuk penyakit metabolik bawaan pada bayi baru lahir menggunakan spektrometri massa tandem. BMJ. 2002; jilid 324 (7328); P. 4-5.
3. Millington D., Kodo N., Terada N., Roe D., Chace D. Analisis penanda diagnostik kelainan genetik pada darah dan urin manusia menggunakan spektrometri massa tandem dengan spektrometri massa ion sekunder cair.1991 Int.J.Mass Spectr .Proses Ion. 111:211-28.
4. Chace D.H. Spektrometri massa di laboratorium klinis. Kimia Rev. 2001 Februari;101(2):445-77.
5. Duran M., Ketting D., Dorland L., Wadman S.K. Identifikasi asilkarnitin dengan spektrometri massa ionisasi kimia desorpsi. J Mewarisi Metab Dis. 1985;8 Suppl 2:143-4.
6. Millington D.S., Kodo N., Norwood D.L., Roe C.R. Spektrometri massa tandem: metode baru untuk profil asilkarnitin dengan potensi skrining neonatal untuk kesalahan metabolisme bawaan. J Mewarisi Metab Dis. 1990;13(3):321-4.
7. Chace D.H., DiPerna J.C., Mitchell B.L., Sgroi B., Hofman L.F., Naylor E.W.. Spektrometri massa tandem elektrospray untuk analisis asilkarnitin dalam spesimen darah postmortem kering yang dikumpulkan pada otopsi dari bayi dengan penyebab kematian yang tidak dapat dijelaskan. Kimia Klinik. 2001;47(7):1166-82.
8. Rashed M.S., Bucknall M.P., Little D., Awad A., Jacob M., Alamoudi M., Alwattar M., Ozand P.T. Skrining bercak darah untuk kesalahan metabolisme bawaan dengan spektrometri massa tandem elektrospray dengan proses batch microplate dan algoritme komputer untuk penandaan otomatis profil abnormal. Kimia Klinik. 1997 Juli; 43(7):1129-41.
9. Millington D.S., Terada N., Chace D.H., Chen Y.T., Ding J.H., Kodo N., Roe C.R. Peran spektrometri massa tandem dalam diagnosis gangguan oksidasi asam lemak. Klinik Prog Biol Res. 1992; 375:339-54.
10. Rashed M.S., Ozan P.T., Harrison ME, Watkins P.J.F., Evans S. 1994. Spektrometri massa tandem elektrospray dalam analisis asam organik. Komunitas Cepat. spektrum massa. 8:122-33
11. Vreken P., van Lint A.E., Bootsma A.H., Overmars H., Wanders R.J., van Gennip A.H. Diagnosis cepat dari acidemias organik dan cacat oksidasi asam lemak dengan analisis elektrospray tandem-MS asil-karnitin kuantitatif dalam plasma. Adv Exp Med Biol. 1999; 466:327-37.
12. Griffiths W.J., Jonsson A..P, Liu S., Rai D.K., Wang Y. Electrospray dan spektrometri massa tandem dalam biokimia. Biochem J. 2001 1 Mei; 355(Pt 3):545-61.
13. Dooley K.C. Spektrometri massa tandem di laboratorium kimia klinis. Klinik Biokimia. 2003 Sep; 36(6):471-81.
14. Mikhailova S.V., Ilyina E.S., Zakharova E.Yu., Baydakova G.V., Bembeeva R.Ts., Shekhter O.V., Zakharov S.F. “Kekurangan beberapa karboksilase disebabkan oleh mutasi pada gen biotinidase // Genetika medis. - 2005. - No. 2. - C.633-638.
15. Baydakova G.V., Bukina A.M., Goncharov V.M., Shekhter O.V., Bukina T.M., Pokrovskaya A.Ya., Zakharova E.Yu., Mikhailova S.V., Fedonyuk I .D., Kolpakchi L.M., Semykina L.I., Ilyina Diagnosis penyakit metabolik herediter berdasarkan kombinasi metode spektrometri massa tandem dan diagnostik enzim, Genetika medis, 2005, vol. 4, no. 1, hlm. 28-33.
16. Zakharova E.Yu., Ilyina E.S., Bukina A.M., Bukina T.M., Zakharov S.F., Mikhailova S.F., Fedonyuk I.D., Baidakova G.V., Semykina L. .I., Kolpakchi L.M., Zaitseva M.N. "Hasil skrining selektif untuk penyakit metabolik herediter di antara pasien departemen neuropsikiatri". Kongres Seluruh Rusia Kedua, Teknologi modern in Pediatrics and Pediatric Surgery,” Proceedings of Congress, hlm. 141-142.
17. Baidakova G.V., Boukina A.M., Boukina T.M., Shechter O.V., Michaylova S.V. I'lina E.S, Zakharova E.Yu Kombinasi spektrometri massa tandem dan analisis enzim lisosom - alat yang efektif untuk skrining selektif untuk IEM di klinik neurologis. Simposium Tahunan ke-41 SSIEM, Amsterdam, 31 Agustus - 3 September 2004.
18. Mikhaylova S.V., Baydakova G.V., Zakharova E.Y., Il'ina E.S. Kasus pertama defisiensi biotinidase di Rusia. European Journal of Human Genetics Vol.13-Supplement1-Mei, 2005, p. 386.
19. Baydakova G.V., Zakharova E.Yu., Zinchenko R.A. Defisiensi dehidrogenase asam lemak asil-KoA rantai menengah. Materi Kongres V Masyarakat Genetika Medis Rusia, Ufa, Mei 2005, Genetika Medis, vol.4, no.4, hlm. 153.
20. Zakharova E.Yu., Baydakova G.V., Shekhter O.V., Ilyina E.S., Mikhailova S.V. Spektrometri massa tandem - pendekatan baru untuk mendiagnosis gangguan metabolisme herediter, Prosiding Kongres V Masyarakat Genetika Medis Rusia, Ufa, Mei 2005, Genetika Medis, vol. 4, no. 4, p.188.
21. Mikhaylova S.V., Zakharova E.Y, Baidakova G.V., Shehter O.V., Ilina E.S. Hasil klinis dari asam glutamat tipe I di Rusia. J. Mewarisi. Metab.Dis 2007, v. 30, hal. 38 22. Baydakova GV, Tsygankova PG. Diagnosis cacat -oksidasi mitokondria di Rusia. J Inherit Metab Dis (2008) 31 (Suppl 1) hal.39

Pelatihan

Apa yang harus dilakukan jika perlu memeriksa anak untuk gangguan metabolisme herediter?

• Dengan penunjukan dokter atau secara mandiri di kantor medis INVITRO mana pun, Anda harus membeli alat tes terlebih dahulu, yang meliputi:

Persiapan belajar dan aturan pengambilan darah bayi baru lahir

1. Pengambilan sampel darah dari bayi baru lahir dilakukan di lembaga kebidanan oleh karyawan yang terlatih khusus, dan dalam kasus pemulangan awal bayi baru lahir (hingga 4 hari kehidupan) - oleh perawat pelindung yang terlatih khusus.
2. Saat memeriksa bayi baru lahir, pengambilan sampel darah harus dilakukan tidak lebih awal dari 4 hari pada bayi cukup bulan dan 7 hari pada bayi prematur. Pada bayi baru lahir, darah diambil dari tumit, pada anak di atas 3 bulan - dari jari.
3. Pada bayi baru lahir, setidaknya 4 hari harus berlalu dari awal menyusui penuh atau pemberian makanan buatan hingga pengambilan sampel darah. Pengambilan sampel darah dilakukan 3 jam setelah menyusui (pada bayi baru lahir - sebelum menyusui berikutnya).
4. Sebelum mengambil darah dari bayi yang baru lahir, kaki anak harus dicuci bersih dengan sabun, dilap dengan kapas steril yang dibasahi dengan alkohol 70%, dan kemudian area yang dirawat harus dibersihkan dengan kain kering steril!
5. Tusukan dibuat dengan scarifier steril sekali pakai hingga kedalaman 2,0 mm (zona tusukan ditunjukkan pada). Tetesan darah pertama dikeluarkan dengan kapas kering yang steril.
6. Dengan tekanan lembut pada tumit, mereka berkontribusi pada akumulasi setetes darah kedua, di mana kartu kertas saring khusus diterapkan secara tegak lurus dan sepenuhnya dan benar-benar memenuhi 5 zona yang digariskan oleh garis melingkar. Noda darah tidak boleh lebih kecil dari ukuran yang tertera pada formulir, jenis noda harus sama pada kedua sisinya. Jangan pernah menggunakan sisi berlawanan dari kertas saring untuk mengisi lingkaran.
7. Setelah mengambil darah, keringkan area tusukan dengan kapas steril dan oleskan patch bakterisida ke tempat tusukan. Perhatian! Keakuratan dan keandalan penelitian tergantung pada kualitas pengambilan sampel darah!
8. Keringkan kartu kertas saring khusus setidaknya selama 2-4 jam pada suhu kamar. Hindari sinar matahari langsung! Untuk melakukan ini, tarik kembali penutup luar kartu dan bawa ujungnya ke bawah permukaan filter yang berlawanan (di mana lingkaran tidak ditunjukkan), . Setelah tetesan darah benar-benar kering, pindahkan penutup kartu di atas permukaan filter. Tanda tangani Nama Keluarga dan I.O. anak di bagian bawah kartu (Nama) dan tunjukkan tanggal pengambilan sampel darah (Tanggal), . Masukkan kartu ke dalam amplop kecil dan masukkan ke dalam amplop besar yang telah ditandatangani sebelumnya. Isi formulir pemesanan dan lampirkan juga dalam amplop besar.
9. Berikan amplop besar ke kantor medis INVITRO terdekat (amplop tidak disegel). Seorang karyawan INVITRO akan memeriksa isi amplop dan kebenaran pengisian formulir pemesanan di hadapan Anda.

Penyimpanan dan transportasi: sebelum dan sesudah pengambilan sampel darah, simpan kit pada suhu kamar di tempat yang kering; hindari kontak dengan sistem pemanas; hindari sinar matahari langsung; saat mengangkut, kemas set dalam kantong plastik tertutup.

Indikasi untuk janji

• Kasus serupa dari penyakit dalam keluarga.
• Kasus kematian mendadak seorang anak di usia dini dalam keluarga.
• Penurunan tajam dalam kondisi anak setelah periode perkembangan normal yang singkat (periode tanpa gejala bisa dari beberapa jam hingga beberapa minggu).
• Bau badan dan/atau urin yang tidak biasa (“manis”, “tikus”, “kubis rebus”, “kaki berkeringat”, dll.).
• Gangguan neurologis - gangguan kesadaran (letargi, koma), jenis yang berbeda kejang, perubahan tonus otot (hipotensi otot atau tetraparesis spastik).
• Gangguan irama pernapasan (bradipnea, takipnea, apnea).
• Pelanggaran dari organ dan sistem lain (kerusakan hati, hepatosplenomegali, kardiomiopati, retinopati).
• Perubahan parameter laboratorium darah dan urin - neutropenia, anemia, asidosis metabolik / alkalosis, hipoglikemia / hiperglikemia, peningkatan aktivitas enzim hati dan kadar kreatin fosfokinase, ketonuria.
• Diagnostik tambahan 37 penyakit metabolik herediter bersama dengan program negara wajib untuk mendeteksi 5 penyakit herediter: skrining bayi baru lahir: "HEEL".

Interpretasi hasil

Interpretasi hasil tes berisi informasi untuk dokter yang hadir dan bukan merupakan diagnosis. Informasi di bagian ini tidak boleh digunakan untuk diagnosis diri atau pengobatan sendiri. Diagnosis yang akurat dibuat oleh dokter, menggunakan hasil pemeriksaan ini dan informasi yang perlu dari sumber lain: anamnesis, hasil pemeriksaan lain, dll.

Satuan pengukuran di laboratorium INVITRO: mol/liter. Nilai referensi untuk parameter yang ditentukan (interpretasi terperinci dari hasil)

Interpretasi umum dari hasil

Apa yang harus dilakukan jika penelitian menunjukkan adanya perubahan indikator? Harus dipahami bahwa perubahan yang terdeteksi selama TMS tidak sepenuhnya mengkonfirmasi penyakit, dan dalam beberapa kasus, perlu untuk menjalani tes tambahan (lihat daftar tes tambahan dan) untuk memverifikasi keandalan pelanggaran yang diidentifikasi. Disarankan untuk berkonsultasi dengan ahli genetika dan dokter anak untuk mengembangkan taktik tindakan bersama. Literatur yang digunakan (nilai referensi)

1. Wiley V., Carpenter K., Wilcken B. Skrining bayi baru lahir dengan spektrometri massa tandem: pengalaman 12 bulan di NSW Australia. Acta Pediatrica 1999; 88 (Suppl): 48-51.
2. Rashed MS, Rahbeeni Z, Ozand PT. Penerapan spektrometri massa tandem elektrospray untuk skrining neonatal. Semin Perinatol 1999; 23:183-93.
3. Schulze A., Lindner M., Kohlmüller D., Olgemöller K., Mayatepek E., Hoffmann G.F. Skrining Bayi Baru Lahir yang Diperluas untuk Kesalahan Metabolisme Bawaan dengan Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry: Hasil, Hasil, dan Implikasi, Pediatrics, 2003; 111; 1399-1406.
4. Hoffman G., Litsheim T., Laessig R. Implementasi spektrometri massa tandem dalam program skrining bayi baru lahir Wisconsin. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2001; 50 (RR-3): 26–7.
5. Lin W.D., Wu J.Y., Lai C.C., Tsai F.J., Tsai C.H., Lin S.P., Niu D.M. Sebuah studi percontohan skrining neonatal dengan spektrometri massa tandem ionisasi elektrospray di Taiwan. Acta Paediatr Taiwan 2001; 42:224-30.
6. Zytkovicz T.H., Fitzgerald E.F., Marsden D., Larson C.A., Shih V.E., Johnson D.M., dkk. Analisis spektrometri massa tandem untuk gangguan amino, organik, dan asam lemak pada bercak darah kering yang baru lahir: ringkasan dua tahun dari Program Skrining Bayi Baru Lahir New England. Clin Chem 2001;47:1945–55.

Prinsip umum diagnosis laboratorium penyakit metabolik herediter

Pada tingkat klinis, diagnosis NBO hanya dapat dicurigai, dan diagnosis lebih lanjut sepenuhnya bergantung pada penggunaan obat yang tidak biasa jarak yang lebar metode genetik biokimia dan molekuler. Dalam kebanyakan kasus, hanya interpretasi gabungan dari semua hasil yang diperoleh yang memungkinkan untuk secara akurat menentukan bentuk penyakit.

Strategi untuk diagnosis NBO yang andal mencakup beberapa tahap: 1. Identifikasi tautan yang rusak di jalur metabolisme melalui analisis (kuantitatif, semi-kuantitatif atau kualitatif) dari metabolit yang relevan; 2. Identifikasi disfungsi protein dengan menilai jumlah dan/atau aktivitasnya; 3. Mengetahui sifat mutasi, mis. karakterisasi alel mutan pada tingkat gen.

Strategi semacam itu digunakan tidak hanya untuk memecahkan masalah ilmiah yang berkaitan dengan studi metabolisme normal, mekanisme molekuler patogenesis NBO, dan identifikasi korelasi geno-fenotipik, pertama-tama perlu untuk diagnosis praktis NBO. Verifikasi diagnosis pada tingkat protein dan gen mutan diperlukan baik untuk diagnosis prenatal, konseling genetik medis keluarga terbebani, dan dalam beberapa kasus untuk penunjukan terapi yang memadai. Misalnya, pada defisiensi dihidropteridin reduktase, fenotipe klinis dan kadar fenilalanin tidak dapat dibedakan dari bentuk klasik PKU, tetapi pendekatan pengobatan penyakit ini pada dasarnya berbeda. Pentingnya diferensiasi lokus NBO untuk konseling genetik medis dapat ditunjukkan dengan contoh mucopolysaccharidosis tipe II (penyakit Hunter). Menurut spektrum glikosaminoglikan yang diekskresikan, tidak mungkin untuk membedakan antara mucopolysaccharidosis tipe II, I dan VII, tetapi dari penyakit ini, hanya penyakit Hunter yang diturunkan menurut tipe resesif terkait-X, yang sangat penting untuk prognosis keturunan dalam keluarga yang terbebani. Prioritas metode genetik molekuler tidak bersyarat dalam menetapkan pembawa heterozigot, serta dalam diagnosis prenatal penyakit di mana enzim mutan tidak diekspresikan dalam sel chorionic villus.

Tahap studi metabolisme

Penilaian metabolit dalam cairan biologis merupakan langkah penting dalam diagnosis aminoasidopati, asiduria organik, mukopolisakaridosis, penyakit mitokondria dan peroksisomal, defek pada metabolisme purin dan pirimidin, dll. Metode analisis permainan kromatografi peran penting dalam diagnosis NBO. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa gudang teknologi kromatografi modern sangat luas dan memungkinkan pemisahan yang efisien dan informatif dari campuran multikomponen yang kompleks, termasuk bahan biologis. Untuk penyaringan selektif NBO, kromatografi lapis tipis berhasil digunakan, yang memungkinkan untuk memperoleh informasi pada tingkat kualitatif. Metode kromatografi ini berlaku untuk pemisahan asam amino, purin dan pirimidin, karbohidrat, oligosakarida. Untuk Analisis kuantitatif Penanda metabolit NBO berhasil digunakan dengan metode kromatografi seperti kromatografi gas dan cair kinerja tinggi, serta spektrometri massa kromatografi (GC, HPLC dan CMS, masing-masing). GC dan HPLC adalah metode universal untuk memisahkan campuran kompleks senyawa, mereka dibedakan oleh sensitivitas dan reproduktifitas tinggi. Dalam kedua kasus, pemisahan dilakukan sebagai hasil interaksi yang berbeda dari komponen campuran dengan fase diam dan fase gerak kolom kromatografi. Untuk GC fase gerak adalah gas pembawa, untuk HPLC itu adalah cair (eluen). Output dari setiap senyawa dicatat oleh detektor perangkat, yang sinyalnya diubah menjadi puncak pada kromatogram. Setiap puncak dicirikan oleh waktu dan area retensi. Perlu dicatat bahwa, sebagai aturan, GC dilakukan pada rezim suhu tinggi, oleh karena itu, ketidakstabilan termal senyawa adalah batasan untuk penggunaannya. Tidak ada batasan seperti itu untuk HPLC, karena dalam hal ini, analisis dilakukan dalam kondisi ringan. CMS adalah sistem GC atau HPLC gabungan dengan detektor selektif massa, yang memungkinkan untuk memperoleh tidak hanya informasi kuantitatif tetapi juga kualitatif, yaitu. selain itu, struktur senyawa dalam campuran yang dianalisis ditentukan.

Salah satu arah yang menjanjikan dalam pengembangan program diagnostik NBO adalah penggunaan metode yang memungkinkan penentuan kuantitatif banyak metabolit yang merupakan penanda. kelompok yang berbeda NBO. Metode tersebut termasuk spektrometri massa tandem (TMS). TMS memungkinkan Anda untuk mengkarakterisasi struktur, berat molekul dan menghitung 3000 senyawa secara bersamaan. Ini tidak memerlukan persiapan sampel jangka panjang untuk analisis (seperti, misalnya, untuk GC), dan analisis membutuhkan waktu beberapa detik.

Tahap penelitian protein mutan

Studi tentang protein mutan dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai metode:

1. Penentuan aktivitas enzim menggunakan substrat alami;
2. Penentuan aktivitas enzim menggunakan substrat buatan;
3. Memuat fibroblas yang dikultur dengan substrat yang terakumulasi;
4. Pengukuran konsentrasi protein menggunakan metode imunokimia.

Bahan untuk mengukur aktivitas enzim dalam NBO terutama leukosit darah perifer: di hampir semua penyakit penyimpanan lisosom, aciduria methylmalonic, dan beberapa glikogenosis. Plasma darah atau serum digunakan untuk mendiagnosis gangliosidosis GM2 dan defisiensi biotinidase. Dalam beberapa kasus, objek penelitian adalah otot atau jaringan hati: enzim rantai pernapasan mitokondria, glikogenosis. Kultur fibroblas kulit juga banyak digunakan untuk diagnosis.

Tahap penelitian gen mutan

Perkembangan metode biologi molekuler telah menjadi revolusi nyata di bidang biokimia klinis. Pengembangan protokol standar untuk studi molekuler dan otomatisasi metode yang digunakan saat ini merupakan satu set lengkap pendekatan diagnostik dan, bersama dengan metode biokimia prosedur rutin di laboratorium klinis. Pesatnya perkembangan penelitian di bidang penguraian genom manusia dan penentuan urutan DNA gen sekarang memungkinkan untuk mendiagnosa DNA diagnostik berbagai penyakit keturunan. Metode diagnostik DNA dan analisis struktur gen normal dan analog mutannya pada penyakit metabolik herediter telah digunakan selama dekade terakhir.

Untuk diagnostik DNA penyakit keturunan, dua pendekatan utama digunakan - diagnostik DNA langsung dan tidak langsung. Diagnostik DNA langsung adalah studi tentang struktur utama gen yang rusak dan isolasi mutasi yang menyebabkan penyakit. Untuk mendeteksi kerusakan molekuler pada gen yang menyebabkan penyakit keturunan, digunakan metode biologi molekuler standar. Tergantung pada karakteristik dan jenis mutasi, frekuensi kemunculannya di berbagai penyakit keturunan, satu metode atau lainnya lebih disukai.

Untuk diagnosis NBO, dalam kasus di mana cacat biokimia diketahui dengan tepat, mudah dan andal ditentukan dengan menggunakan metode biokimia, metode DNA tidak mungkin menjadi prioritas. Dalam kasus ini, penggunaan analisis DNA lebih merupakan penelitian daripada pendekatan diagnostik. Namun, setelah diagnosis yang ditetapkan secara akurat, metode analisis DNA akan berguna untuk diagnosis prenatal berikutnya, identifikasi pembawa heterozigot dalam keluarga dan prognosis penyakit pada homozigot, serta untuk pemilihan pasien untuk tujuan melakukan terapi kasual di masa depan (penggantian enzim dan terapi gen). Juga, dalam kasus di mana cacat biokimia tidak diketahui secara pasti, diagnosis biokimia sulit, tidak cukup dapat diandalkan atau memerlukan metode penelitian invasif, metode diagnostik DNA adalah satu-satunya dan sangat diperlukan untuk diagnosis yang akurat.

DI DALAM pandangan umum taktik mendiagnosis NBO dalam setiap kasus spesifik harus direncanakan bersama dengan ahli biokimia dan ahli genetika. Kondisi yang diperlukan sukses dan diagnosis cepat adalah pemahaman tentang etiologi, mekanisme patogenesis penyakit, pengetahuan tentang penanda biokimia tertentu.